酶免技術(shù)常應(yīng)用的酶有辣根過(guò)氧化酶和堿性磷酸酶，針對(duì)不同的酶，所作用的底物又是不同的。

　　1.辣根過(guò)氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無(wú)色糖蛋白，在275nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，

　　在403nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰。HRP對(duì)受氫體的專(zhuān)一性很高，除H₂0₂外，僅作用于小分子醇的過(guò)氧化物和尿素的過(guò)氧化物。后者為固體，作為試劑較H₂0₂方便。

　　許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS。OPD為在ELISA中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB無(wú)此缺點(diǎn)。TMB經(jīng)酶作用后由無(wú)色變藍(lán)色，目測(cè)對(duì)比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計(jì)中定量；因此應(yīng)用日見(jiàn)增多。ABTS，雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。

　　2.堿性磷酸酶（AP）：是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的最適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為100kD，最適pH為9.6。一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。

　　在ELISA中應(yīng)用AP系統(tǒng)，其敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，制備酶結(jié)合物時(shí)得率較HRP低等醫(yī)學(xué)教丨育網(wǎng)整理原因，國(guó)內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。

　　3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-半乳糖苷，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮，可用熒光計(jì)檢測(cè)。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應(yīng)用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點(diǎn)是需要熒光計(jì)測(cè)定，而且如用固相載體直接作為測(cè)定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點(diǎn)是酶作用后反應(yīng)液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒(méi)有內(nèi)源酶。