登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則附錄A：登革熱血清學(xué)檢測(cè)方法

A1 應(yīng)用IgM捕捉ELISA法檢測(cè)DFIgM抗體

AI.1原理

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，利用抗人謬鏈單克隆抗體捕獲待檢測(cè)血清中的IgM，再加入特異性抗原和相應(yīng)酶標(biāo)單克隆抗體，加底物顯色。顯色程度與特異性IgM抗體含量呈正相關(guān)，以待檢血清與特異性抗原和陰性血清（對(duì)照）與抗原反應(yīng)光密度（0D）值的比值，作為判定IgM抗體反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

A1.2材料

A1.2.1 96孔聚苯乙烯U型塑料板、酶標(biāo)儀。

A1.2.2 10～100μL可調(diào)加樣器1支、10 mL吸管若干。

A1.2.3抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體。

A1.2.4抗原

a） Cs/36細(xì)胞培養(yǎng)的各型DV為陽性抗原。

b）未接種病毒的正常CJ36細(xì)胞為陰性抗原對(duì)照。

（抗原制備：病毒接種CJ36細(xì)胞，病變達(dá)“+++”，凍融3次，用波長(zhǎng)14～22 kHz超聲波粉碎3次，每次30 s.3 000 r/min離心15 min，上清即為抗原。

A1.2.5抗IgM陰性或陽性對(duì)照血清

A1.2.6辣根過氧化物酶標(biāo)化DVI～4型單克隆抗體。

A1.2.7緩沖液

a.洗液：O.05%吐溫-20 pH7.4PBS

b.稀釋液：10%牛血清 pH7.4PBS

c.封閉液：1%牛血清白蛋白 pH9.6碳酸緩沖液

A1.2.8底物：鄰苯二胺溶液（pH5.O磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液100mL，鄰苯二胺40 mg，30%過氧化氫溶液0.15 mL，臨用前按需配制，立即使用）。

A1.2.9終止液：1 mol/L硫酸。

A1.3檢測(cè)方法

A1.3.1用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人μ鏈，每孔加0.1 mL，加蓋，4℃過夜。

A1.3.2棄去抗人μ鏈。用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加封閉液，每孔0.1mL，37℃水浴2h.

A1.3.3棄封閉液。用洗滌液重復(fù)洗滌3次，甩干，加1：10待檢血清，每標(biāo)本加10孔，每孔0.1 mL，37℃水浴2h.

A1.3.4棄血清，用洗滌液重復(fù)洗滌3次，甩干，分別加4個(gè)型DV抗原及陰性抗原對(duì)照，按順序各加2孔至每份待檢血清的10個(gè)孔中，每孔0.1mL，4℃過夜。

A1.3.5棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗滌3次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的DF酶標(biāo)單克隆抗體，正?？乖铀膫€(gè)型混合的酶標(biāo)單克隆抗體，每孔0.1mL，37℃水浴2h.

A1.3.6去標(biāo)記物，用洗滌液重復(fù)洗滌3次，甩干，每孔加入新鮮配制的底物液0.1mL，37℃水浴30 min，顯色。

A1.3.7每孔加1 mol/L硫酸溶液0.05mL，終止反應(yīng)。

A1.4結(jié)果判斷

A1.4.1 酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定OD值（空向?qū)φ照{(diào)零），見式（A1）。

k=（OD₁-OD₀）/（OD₂-OD₀）……………………………………（A1）

式中：OD₁——血清與病毒抗原反應(yīng)的OD值；

OD₀——空白孔的OD值；

OD₂——血清與正常抗原反應(yīng)的OD值。

K≥2.1判為陽性。

A1.4.2目測(cè)法。陽性抗原孔呈淡黃色，桔黃色或淺棕黃色，陰性抗原基本無色。

A1.5意義

IgM抗體陽性，表示患者新近感染DV，適用于DF早期診斷。

A2血凝抑制（HI）試驗(yàn)檢測(cè)DF血凝抑制抗體

A2.1原理

DV有血凝索抗原，在適宜的pH條件下能凝集鵝、雞及綿羊紅細(xì)胞，引起紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被加入的特異抗體所抑制，稱之為血凝抑制試驗(yàn)（HI）?？捎糜谘种瓶贵w的測(cè)定。

A2.2材料

A2.2.1 U型塑料板（96孔）。

A2.2.2 10～100 μL、100～1 000 μL可調(diào)加樣器、10 mL吸管。

A2.2.3 1～4型DV鼠腦蔗糖丙酮抗原或DV C6/36細(xì)胞抗原，抗原與同型抗體滴度應(yīng)大于與異型抗體交叉反應(yīng)2個(gè)滴度以上。

A2.2.4稀釋液，pH6.4磷酸緩沖液，用于稀釋鵝血球。

pH9.O硼酸緩沖鹽水，用于稀釋血凝素和血清。

A2.2.5鵝血球：于鵝翅下靜脈抽血，置于血球保存液混勻，用生理鹽水洗3次，最后以2 000 r/min離心15 min醫(yī)|學(xué)教育網(wǎng)整理，棄去上清，用pH6.4PBS稀釋至0.5%鵝血球懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?

A2.2.6待檢血清處理：用生理鹽水把血清稀釋成1： 10，置56℃水浴滅活30 min.用10倍蚤4℃丙酮處理2次，離心去上清，沉淀物真空干燥，加入pH9.O硼酸緩沖鹽水恢復(fù)到l：10濃度。4℃過夜。然后每管加入50%鵝血球0. 05 mL，37℃水浴30 min.離心沉淀取上清，即為1： 10處理血清。陰、陽性對(duì)照血清同方法處理。

A2.3檢測(cè)步驟

A2.3.1血凝素滴定

在塑料板上，每孔加pH9.0硼酸緩沖鹽水25 μL.各取1～4型DV抗原25 μL各置于第1孔，作倍比稀釋，最后一孔混勻后棄25 μL.然后于每孔補(bǔ)加pH9.O稀釋液25 μL，各加0.5%鵝血球50 μL混勻，置于37℃水浴作用2h，結(jié)果以最高稀釋度出現(xiàn)“++”為1個(gè)血凝單位，正式試驗(yàn)用4個(gè)單位。

A2.3.2血凝抑制試驗(yàn)

在塑料板中，除第1孔外，于各孔加入pH9.0硼酸緩沖鹽水25 μL.第1、2孔和第8孔分別加入25μL巳處理待檢血清，從第2孔開始，作倍比稀釋，最后一孔不稀釋，補(bǔ)加pH9.O硼酸緩沖鹽水25 μL.然后按順序予第1排至第4排各分別加入DV1～4型4個(gè)單位的血凝抗原25 μL.最后一孔不加抗原?；靹?，放37℃水浴2h，再于每孔加0.5%鵝血球50μL，混勻，37℃水浴2h，觀察結(jié)果。

A2.4結(jié)果判斷

以完全抑制鵝血球凝集的血清最高稀釋度倒數(shù)為血凝抑制抗體效價(jià)。

A2.5意義

恢復(fù)期血清滴度比急性期血清滴度有4倍增高可確診。

A3補(bǔ)體結(jié)合（CF）試驗(yàn)

A3.1原理

補(bǔ)體有結(jié)合抗原-抗體復(fù)合物的特性。病毒抗原與特異性抗體（試驗(yàn)材料）形成復(fù)合物時(shí)，加入一定量補(bǔ)體。則補(bǔ)體與之結(jié)合，不再以游離的形式存在，此時(shí)，加入另一對(duì)抗原，抗體（羊血球溶血索），由于后者沒有游離的補(bǔ)體參與反應(yīng)，結(jié)果不溶血，表示補(bǔ)體已結(jié)合于抗原-抗體復(fù)合物中，稱為陽性，如試驗(yàn)材料中沒有病毒抗原一抗體復(fù)合物，則加入的定盤補(bǔ)體仍以游離的形式存在，與再加入的羊血球溶血索反應(yīng)而顯溶血，此為陰性。

A3.2材料及方法

（略）

A3.3意義

單份血清抗體滴度達(dá)1：32，對(duì)診斷登革熱有參考意義，恢復(fù)期血清比急性期血清抗體滴度有4倍抗體增長(zhǎng)可確診。

A4用免疫熒光法（FA/IFA）檢測(cè)雙份血清IgG抗體

A4.1原理

某些熒光索（常用異硫氰酸熒光素）能與抗體蛋白分子結(jié)合，而不喪失抗體活力，仍能和相應(yīng)的抗原發(fā)生特異免疫反應(yīng)，產(chǎn)生免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物由于有熒光色素的參與，在熒光顯微鏡下顯示熒光，表明有特異性抗原存在。直接免疫熒光法可用于檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原，間接免疫熒光法可查待檢血清中的特異性抗體。

A4.2材料

A4.2.1 10～100 μL，100～1 000 μL可調(diào)移液器各1支。

A4.2.2 DV1～4型抗原片（登革標(biāo)準(zhǔn)毒株感染Cs/36細(xì)胞制備，低溫干燥保存）及相應(yīng)單克隆抗體（陽性對(duì)照）、陰性血清。

A4.2.3羊抗人（兔抗人）IgG熒光抗體。

A4.2.4待檢患者血清（急性期和恢復(fù)期）。

A4.2.5常用稀釋液。pH7.2～7.4PBS、伊文斯蘭、封片膠等。

A4.2.6熒光顯微鏡。

A4.3檢測(cè)步驟

A4.3.1取出抗原片，冷風(fēng)吹干。

A4.3.2用pH7.2～7.4PBS稀釋待檢血清，從1：20開始，倍比稀釋至所需稀釋度。

A4.3.3用加樣器依次從商稀釋度向低稀釋度逐個(gè)加入稀釋的待檢血清于四個(gè)型的DV抗原片孔中，每型各加2孔待檢系列稀釋血清，血清最以完全覆蓋抗原面而不溢出孔外為準(zhǔn)，置濕盒內(nèi)，在37℃水浴孵育30 min（每次試驗(yàn)同時(shí)作陰、陽性對(duì)照）。

A4.3.4用pH7.2～7. 4PBS洗滌3次，每次約30 s至1 min，再用蒸餾水洗1次，冷風(fēng)吹干。

A4.3.5用pHT.2～7.4PBS稀釋熒光抗體。使其內(nèi)含2個(gè)工作單位和1 ：8 000伊文斯蘭的熒光抗體，加入各孔中。使完全覆蓋抗原面-置濕盒中，37℃水浴作用30 min.取出，如A4.3.4洗滌及吹干。

A4.3.6用封片膠（或甘油緩沖液）封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

A4.4結(jié)果判斷

特異性熒光呈黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞漿中。根據(jù)熒光亮度和陽性細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占的比例可將熒光反應(yīng)大致區(qū)分為“+～++++”，無熒光者為“-”，檢測(cè)抗體滴度時(shí)，以特異熒光達(dá)“++”最高血清稀釋度的倒數(shù)表示。

A4.5意義

陽性結(jié)果，表明提供血清的個(gè)體曾受到DV感染，大于1：80有診斷參考意義醫(yī)|學(xué)教育網(wǎng)整理?；謴?fù)期抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍或以上升高則可確診。

A5免疫斑點(diǎn)（dengue blot）試驗(yàn)檢測(cè)DV-IgG抗體

A5.1原理

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，把抗原固定于硝酸纖維索膜載體，與待測(cè)血清的特異性抗體結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)記物結(jié)合，通過酶與底物作用產(chǎn)生顏色，表示陽性，陰性不顯色。

A5.2材料及方法

（略）。

A5.5意義

陽性結(jié)果可作為DV感染參考。早期血清“-”，恢復(fù)期血清“+”確診DV感染。

A6 中和試驗(yàn)（NT）

A6.1原理

使用對(duì)病毒敏感的動(dòng)物、細(xì)胞或雞胚為材料，測(cè)定病毒受免疫血清中和殘存感染力與對(duì)照試驗(yàn)組比較，計(jì)算出中和指數(shù)。

A6.2材料和方法

（略）

A6.3意義

中和指數(shù)在9以下為陰性，10～49為可疑，50以上為陽性。用于鑒定病毒和疾病診斷。