登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則附錄B：登革熱病原學(xué)檢測(cè)

B1應(yīng)用單克隆抗體免疫熒光法（mbAb-IFA）檢測(cè)DV抗原

B1.1原理

感染DV的蚊蟲體內(nèi)，攜帶有DV抗原，可用DV單克隆抗體免疫熒光法檢出蟻體內(nèi)的特異性抗原。

B1.2材料

多孔載玻片、10～l00 μL可調(diào)加樣器、染色缽、試管、pH7.2PBS Dl～D4型單克隆抗體、羊抗鼠IgG、丙酮等。

B1.3檢測(cè)步驟（問接法）

B1.3.1 蚊蟲標(biāo)本制備：待蚊蟲胃內(nèi)容物消化后，置-40℃凍死，用解剖刀去翅，肢，將頭部和軀體分別放于載玻片圈內(nèi)，蓋上一塊與之相對(duì)應(yīng)的玻片，輕輕加壓，使蚊組織最大限度地附在玻片上，小心分開兩玻片，用鑷子去除大片的骨骼，吹干，冷丙酮固定10 min.

B1.3.2用PBS輕輕洗一次，再用蒸餾水洗一次，吹干。

B1.3.3加DF單克隆抗體，覆盞蚊組織，置于濕盒中，37℃水浴30 min.

B1.3.4取出，用PBS洗2次，蒸餾水洗1次，吹干。

B1.3.5加羊抗鼠lgG，如B1.3.3、B1.3.4，孵育，洗滌。

B1.3.6封片膠封片，熒光鏡檢。如單抗已熒光標(biāo)記則免去BI. 3.5，即為直接法。

B1.4結(jié)果判斷

用熒光顯微鏡觀察，檢出組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有特異性黃綠色熒光，判為陽性醫(yī)|學(xué)教育網(wǎng)整理，陰性無熒光出現(xiàn)。

B1.5 意義

在蚊蟲組織中，檢出DV抗原?？纱_診被檢蚊蟲攜帶有DV，可用于登革熱流行病學(xué)調(diào)查。

B2 C6/36白紋伊蚊細(xì)胞分離DV

B2.1原理

DV是一種具有嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)存活的生物，必須生活在活的細(xì)胞組織內(nèi)。C6/36白紋伊蚊細(xì)胞對(duì)DV十分敏感，藉觀察病毒對(duì)其產(chǎn)生的變化（病變等現(xiàn)象）和應(yīng)用特異、敏感的檢測(cè)技術(shù)，檢出病毒的存在和型別。

B2.2材料

C6/36白紋伊蚊細(xì)胞、新生小牛血清、日本Eagles、青霉索、鏈霉素、各型DV單克隆抗休、羊抗鼠熒光IgG及免疫熒光試驗(yàn)用品。

B2.3檢材的采集及處理

B2.3.1病人：無菌采集發(fā)病后5d內(nèi)靜脈血3 mL.放冰壺送實(shí)驗(yàn)室分離血清接種組織培養(yǎng)，不能及時(shí)接種的可放-20℃保存。對(duì)污染的血漬要先加青霉索、鏈霉素（最終濃度各為500 kU/L）。4℃作用2h處理后按種。接種后余下的血消為早期血清，供血濟(jì)學(xué)試驗(yàn)用。

B2. 3.2尸體檢材：可取血，腦行液、腦組織、肝等。

B2.3.3蚊：采集吸過血的埃及伊蚊。白紋伊蚊或其他可疑蚊種，用0.50 mol/L（10%）葡萄搪液喂養(yǎng)，至胃血完全消化后置-20℃，待死后按蚊種及捕獲地點(diǎn)分組，以5～10只一組為宜，經(jīng)生理鹽水沖洗數(shù)次后，用研磨器研碎，每組加0.5 mL Hank's液，2 000 r/min離心15 min，取上清液加青霉素、鏈霉素【最終濃度1 MU/L（1 000 U/mL）】4℃過夜，備用。

B2.4病毒分離

C6136（白紋伊蚊純系細(xì)胞株）傳代細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，倒去培養(yǎng)液，每管接種月Hank's液稀釋成10-1的患者血清0.1mL或蚊懸液或組織懸液0.2 mL，37℃吸附l h后加維持液0.9 mL及0.8mL，置35 ℃靜止培養(yǎng)，觀察7天，若細(xì)胞出現(xiàn)膨大至融合，折光度增強(qiáng)、顆粒增多等現(xiàn)象，取細(xì)胞懸液0.1 mL，進(jìn)行傳代，仍出現(xiàn)同樣病變者應(yīng)保種并進(jìn)行鑒定，若7天后細(xì)胞不出現(xiàn)病變，需盲傳l～2代，仍不出現(xiàn)病變者用問接免疫熒光試驗(yàn)作進(jìn)一步檢查，陰性者作陰性報(bào)告。

B2.5間接免疫熒光試驗(yàn)（FA/IFA）鑒定DV

B2.5.1 試驗(yàn)方法

B2.5.1.1 細(xì)胞片的制備：把出現(xiàn)“++”病變的C6/36細(xì)胞管倒去維持液，（若不出現(xiàn)病變醫(yī)|學(xué)教育網(wǎng)整理，則需培養(yǎng)7天再制片）用pH7. 2PBS洗2次后加PBS 3 mL，用滴管把細(xì)胞從管壁上吹下，吹散，2 000 r/min離心5 min，棄去PBS.加O～2 mLPBS把沉淤吹散，滴加在10孔的載玻片符孔中，電風(fēng)扇吹干，加冷丙酮固定10 min，用PBS沖洗2次，蒸餾水漂洗1次，吹干，-20℃保存。正常C6/36細(xì)胞對(duì)照按同法制片。

B2.5. 1.2試驗(yàn)方法：取出保存的待鑒定細(xì)胞片或腑組織片，吹干，于各孔中按順序滴加4個(gè)型DV使用單位的單克隆抗體，備型2孔，對(duì)照2孔滴加PBS，置濕盒內(nèi)37℃水浴30 min.取出用PBS沖洗3次，蒸餾水深洗1次，吹干，滴加含130 μmol/L（1 ：8 000）伊文思蘭的2單位抗鼠IgG熒光抗體，置濕眾內(nèi)37℃水浴30 min，用PBS沖洗3次，蒸餾水漂洗1次，吹干，用甘油緩沖液封片，鏡檢，記錄結(jié)果。

B2.5.2結(jié)果判斷

特異性免疫熒光呈黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)，正常組織細(xì)胞被染成橙紅色或暗紅。

B2.5.3意義

從病人血液、組織或蚊媒中分離出DV，經(jīng)鑒定，可確診DV感染和病毒型別。

B3應(yīng)用乳小白鼠分離DV

B3.1原理

新生小白鼠對(duì)DV十分敏感，藉觀察病毒對(duì)其產(chǎn)生的致病等現(xiàn)象和應(yīng)用特異、敏感的檢測(cè)技術(shù)，檢出病毒的存在和型別。

B3.2材料

同B2.2.C6/36白紋伊蚊細(xì)胞改用1～3日齡乳小白鼠。

B3.3檢材采集及處理

參考B2.3.

B3.4病毒分離

每一檢材接種一窩l～3日齡小白鼠，每只腦內(nèi)接種全血或1：10血清或蚊懸液、組織懸液10～20μL，接種后48 h內(nèi)死亡者作非特異性死亡，棄去。存活者觀察至10 d左右仍未發(fā)病時(shí)，剖取其中2只， 取腦，用pH8.0肉湯制成10%懸液，盲傳1～3口齡小白鼠一窩，其余的及盲傳的均觀察至第四周。未發(fā)病作陰性結(jié)果：在觀察期內(nèi)若發(fā)?。ㄋ擅?、蜷縮、活動(dòng)力降低、站立不穩(wěn)、抽搐、離群、不進(jìn)食、癱瘓等癥狀）則削取半邊腦，按盲傳法制成10%鼠腦懸液，轉(zhuǎn)種1～3日齡小白鼠，并作無菌試驗(yàn)。另一半腦置5.43 mol/L（50%）甘油緩沖液中低溫保存。無菌試驗(yàn)陰性而重復(fù)以上癥狀的乳鼠作為可疑毒株傳代、保種，并進(jìn)行鑒定。

B3.5病毒鑒定

B3.5.1 問接免疫熒光試驗(yàn)（FA/IFA）

B3.5.1.1 腦組織片的制備；取發(fā)病瀕死的小鼠腦組織以冰凍切片制成10孔組織片，經(jīng)吹干，冷丙酮固定10 min，沖洗、吹干后放-20℃保存。正常腦組織同法制作。

P.3.5.1.2試驗(yàn)方法、結(jié)果和意義，同B2.5.

B3.5.2血凝抑制試驗(yàn)

原理、材料與方法參考人2.

意義：鑒定病毒和病毒分型。

a3.5.3補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

原理、材料與方法、意義參考A3.

s3.5.4中和試驗(yàn)

原理、材料與方法、意義參考A6.

B4 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)DF病毒基因及基因分型

B4.1原理

PCR技術(shù)（聚合酶鏈反應(yīng)）是利用雙鏈脫氧核糖核酸（DNA）分子堿基配對(duì)原則，在一定條件下擴(kuò)增DNA片段的體外擴(kuò)增方法。它的特異性取決于兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物的序列。引物與待擴(kuò)增片段兩條鏈兩段DNA序列分別互補(bǔ)，待擴(kuò)增DNA在變性溫度下分解為二條單鏈模板。在復(fù)性溫度引物與模板兩端的DNA序列分別復(fù)性（雜交，堿基配對(duì)）。在延伸溫度和單核背酸存在的條件下，由TaqDNA聚合酶催化，引導(dǎo)引物的5，向3，方向延伸合成新鏈，是一個(gè)重復(fù)進(jìn)行的熱變性復(fù)性延伸的溫控循環(huán)過程，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，DNA產(chǎn)量呈指數(shù)上升，經(jīng)過20個(gè)循環(huán)以后，從微量基因材料。特異性地?cái)U(kuò)增可達(dá)數(shù)百萬倍。

登革病毒含核糖核酸（RNA）基因組，因此PCR前需經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶作用。合成第一條cDNA鏈（RT），再進(jìn)行擴(kuò)增（PCR），即RT-PCR.設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物可擴(kuò)增登革病毒組基因。設(shè)計(jì)不同型登革病毒的引物對(duì)，可擴(kuò)增出不同的基因型病毒的基因產(chǎn)物。

B4.2材料及方法

（略）。

B4.3 意義

此法可對(duì)早期病例DV的檢測(cè)及分型鑒定。