【關(guān)鍵詞】  代謝組學(xué)； 中西醫(yī)結(jié)合； 醫(yī)學(xué)； 綜述

　　代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一種研究生物系統(tǒng)的組學(xué)方法。它是英國Nicholson教授及其同事于1999年正式提出的［1］。代謝組指的是“一個細(xì)胞、組織或器官中，所有代謝組分的集合，尤其指小分子物質(zhì)”，而代謝組學(xué)則是一門“在新陳代謝的動態(tài)過程中，系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，揭示機(jī)體生命活動代謝本質(zhì)”的科學(xué)［2］，它所關(guān)注的是相對分子質(zhì)量為1 000以下的小分子。近年來代謝組研究已引起眾多研究者的注意，代謝組學(xué)與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)不同，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴你可能發(fā)生什么，而代謝組學(xué)則告訴你已經(jīng)發(fā)生了什么；還有研究者認(rèn)為代謝組學(xué)是“組學(xué)”研究的終端［3］。為更好地將代謝組技術(shù)應(yīng)用于中西醫(yī)結(jié)合研究中，本文根據(jù)近年來國外的相關(guān)資料，對代謝組學(xué)的實驗技術(shù)、分析技術(shù)及其在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，同時對代謝組學(xué)在中西醫(yī)結(jié)合研究中的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

　　1  代謝組學(xué)的實驗技術(shù)

　　1.1  代謝組學(xué)研究的常用技術(shù)  代謝組學(xué)研究常用核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，比如氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer， GCMS）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatographymass spectrometer， LCMS）等［4］。核磁共振光譜分析法是目前代謝組學(xué)研究應(yīng)用最廣泛的方法，NMR的優(yōu)勢在于對樣品無破壞性，樣品處理簡單，無需分離過程；缺點是靈敏度低，很難同時測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產(chǎn)物，所需硬件的投資也較大。目前常用的是1DNMR，比如Brindle等［5］應(yīng)用NMR研究高血壓患者血清的代謝譜特征；Lehnhardt等［6］應(yīng)用NMR研究原發(fā)性和繼發(fā)性腦腫瘤的代謝譜差異等。1DNMR光譜的信息量大，但不可避免地存在峰圖的重疊，影響了隨后的分析，而2DNMR大大地改善了1DNMR峰圖的質(zhì)量［7］，一些研究者開始應(yīng)用2DNMR開展代謝組研究，如Choi等［8］為了研究被煙草花葉病毒感染煙草的代謝譜變化，應(yīng)用2DNMR方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5綠原酸等代謝物明顯增多。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用是當(dāng)前最為活躍的聯(lián)用技術(shù)，一般供試物經(jīng)GC分離為單一組分，按其不同保留時間，與載氣同時流出色譜柱，再經(jīng)接口，進(jìn)入質(zhì)譜儀，然后可通過EI或其他方法產(chǎn)生一定的MS圖譜。GCMS有很好的分離效率，可由計算機(jī)對MS圖譜進(jìn)行化合物數(shù)據(jù)庫的自動檢索核對，有利于迅速鑒識樣品。缺點是需要對樣品進(jìn)行衍生化預(yù)處理，這一步驟額外費時，甚至引起樣品的變化；衍生化預(yù)處理限制了GCMS的應(yīng)用范圍，無法分析熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)和分子量較大的代謝產(chǎn)物。如A等［9］針對GCMS的代謝組研究，應(yīng)用多元統(tǒng)計方法對人血漿的提取和衍生化預(yù)處理方法進(jìn)行了研究。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用主要是高效液相色譜質(zhì)譜（high performance liquid chromatographymass spectrometry， HPLCMS）聯(lián)用，HPLCMS進(jìn)樣前不需進(jìn)行衍生化處理，適合那些不穩(wěn)定、不易衍生化、不易揮發(fā)和分子量較大的化合物。缺點是分離效率不高，分析的時間相對較長；沒有化合物數(shù)據(jù)庫可供檢索和比對，樣品的鑒別還需進(jìn)一步的分析［10］。如Yang等［11］使用LCMS方法結(jié)合主成分分析（principle component analysis， PCA）方法，比較肝炎、肝硬化與肝癌病人的尿液代謝譜的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一組尿代謝物與肝癌的相關(guān)性優(yōu)于傳統(tǒng)單一的甲胎蛋白。無論NMR、色譜和質(zhì)譜都有各自的優(yōu)缺點，為了充分發(fā)揮各種技術(shù)的優(yōu)勢，有研究者將三種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于代謝組的研究。如Lenz等［12］應(yīng)用1HNMR和HPLCTOFMSMS技術(shù)相結(jié)合研究慶大霉素的腎毒性尿液的內(nèi)源性的代謝物變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖增加，三甲胺N氧化物（trimethylamine noxide， TMAO）降低等變化特點。

　　1.2  代謝組學(xué)研究的新技術(shù)  微量樣本是研究中經(jīng)常面對的難題，而毛細(xì)管電泳質(zhì)譜（capillary electrophoresismass spectrometry， CEMS）所需樣品量少，已廣泛地應(yīng)用于代謝組的研究中，如Sato等［13］選擇了CEMS進(jìn)行了水稻葉的代謝物檢測，成功地檢測了88種代謝物，這些代謝物涉及到醣酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、光呼吸作用和氨基酸的生物合成等。近年來為了監(jiān)測活體動物特定組織區(qū)域內(nèi)代謝物的動態(tài)變化，研究者將微透析（microdialysis）技術(shù)引入了代謝組的研究，如Price等［14］應(yīng)用微透析結(jié)合NMR比較了SD大鼠各組織在局部缺血狀態(tài)下的代謝情況。作者提出微量滲析技術(shù)和NMR相結(jié)合是代謝組研究的強(qiáng)有力工具?？梢姶x組同其他實驗技術(shù)一樣，有一個不斷完善的過程，一些研究者正致力于代謝組實驗技術(shù)的研究。

　　1.3  代謝組的研究材料  代謝組研究的樣本包括生物液體和組織，由于血漿和尿液收集簡單、易于長期檢測和包含大量的代謝信息，已經(jīng)成為代謝組研究常用的標(biāo)本；唾液也逐漸成為代謝組研究的另一種生物液體樣本，如Ramadan等［15］選擇了150個健康男性和女性，取唾液、血漿和尿液，應(yīng)用1HNMR研究不同性別之間的代謝物差異等。此外還有應(yīng)用腦脊液進(jìn)行代謝組研究的報道，如Coen等［16］應(yīng)用NMR研究細(xì)菌、真菌、病毒性腦膜炎腦脊液的代謝組變化，進(jìn)行腦膜炎的代謝組臨床診斷的探索研究。血漿或尿液代謝物為全身各細(xì)胞、組織、器官代謝的分泌物，但是血漿或尿液只能代表生物體的平均代謝狀態(tài)或代謝組“整體模式”，不能獲得具體組織的代謝狀態(tài)。組織代謝研究提供了局部的代謝信息，而一些疾病本身可能就只影響了局部的代謝，如Viant等［17］研究早期腦外傷動物模型大腦組織與血漿的代謝物變化，結(jié)果在大腦組織有氧化應(yīng)激（比如維生素C）興奮性中毒（比如谷氨酸）等代謝紊亂，而血漿中并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化，因此組織代謝的研究具有重要的意義。目前組織標(biāo)本研究還不是很多，主要有肝、大腦皮層和小腦等，肝組織主要用于一些毒理學(xué)研究，如Azmi等［18］應(yīng)用NMR技術(shù)，采集肝組織樣本研究肝毒性的代謝組變化等。大腦皮層、小腦組織主要用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，如Griffin等［19］應(yīng)用NMR研究脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)動物模型小腦、大腦的提取物的代謝譜變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺增加，而γ氨基丁酸、膽堿、磷酸膽堿和乳酸鹽下降等特征。

　　1.4  代謝組研究的影響因素  充分了解代謝組研究的影響因素是應(yīng)用好代謝組技術(shù)開展醫(yī)學(xué)研究的前提，目前研究者們已經(jīng)注意到了代謝組研究的影響因素［20］，除了實驗技術(shù)本身對代謝組研究的影響外，還有如樣品制備（抽提溶劑和溫度等）、儀器性能和數(shù)據(jù)分析方法等。不同生理狀態(tài)對代謝組的影響也引起了研究者的重視，比如性別、年齡、飲食、晝夜變化、文化等，因為這是代謝組技術(shù)在臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題［21］。如Stanley［22］等為了探索不同性別間的代謝物差異，選擇了NMR結(jié)合化學(xué)計量方法研究不同性別Wistar大鼠尿液的代謝譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羥苯基丙酸等代謝物存在明顯的性別差異；Kochhar等［23］選擇了150名健康人，應(yīng)用NMR方法研究不同性別人血清和尿液的代謝譜差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)女性脂類的合成高于男性，男性的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換多于女性等差異。Bollard等［24］還綜述了不同生理狀態(tài)下的動物尿的代謝物特征，尤其在不同個體之間、性別、年齡、飲食、物種、品系、激素狀態(tài)、壓力及晝夜變化等，發(fā)現(xiàn)不同的生理狀態(tài)對代謝組有明顯的影響。Lenz等［25］收集了給予標(biāo)準(zhǔn)飲食的12名健康男性相隔14 d的血漿和尿液進(jìn)行NMR檢測，應(yīng)用PCA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿的差異很小，但在尿液中存在很大的個體差異，同時發(fā)現(xiàn)所有受試者代謝譜存在晝夜變化規(guī)律。Lenz等［26］還比較了不同國家之間人群的代謝譜的差異情況，選擇單身的受試者，不進(jìn)行飲食限制，收集晨尿，應(yīng)用NMR進(jìn)行分析，使用PCA分析數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些有統(tǒng)計學(xué)意義的差異，研究表明內(nèi)源性尿代謝譜受到文化、飲食的嚴(yán)重影響，因此在疾病或治療標(biāo)志物的篩選中需要特別注意這些影響因素，此外還需結(jié)合數(shù)學(xué)的方法以排除這些影響因素。

　　2  代謝組的分析技術(shù)

　　2.1  譜峰的預(yù)處理  譜峰的預(yù)處理對代謝組的后期分析有較大的影響，質(zhì)譜峰的預(yù)處理包括背景扣除、濾噪、保留時間校正、譜峰匹配和歸一化或標(biāo)準(zhǔn)化等。NMR譜峰的預(yù)處理包括背景扣除、濾噪、歸一化或標(biāo)準(zhǔn)化等。一些學(xué)者正對譜峰預(yù)處理的方法進(jìn)行研究，比如針對1HNMR原始光譜資料，Stoyanova等［27］介紹了一種基于時間窗口的自動校正譜峰的方法；WebbRobertson等［28］就對譜峰整合和歸一化方法進(jìn)行了研究。此外樣品的分析過程中不可避免地會出現(xiàn)譜峰漂移，F(xiàn)orshed等［29］比較了bucketing和PLF兩種最近發(fā)展的NMR峰位校正法，并應(yīng)用實例對兩種方法進(jìn)行了比較。氣或液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，通過常規(guī)的重疊峰析法后，能分離300多種代謝物，但該方法耗時而且不能自動化。Jonsson等［30］發(fā)展了一種半自動的逐級多元曲線分辨處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)的方法，該方法已經(jīng)應(yīng)用于不同發(fā)育時間植物葉的代謝物研究，結(jié)果表明該法和常規(guī)的重疊峰析法具有類似的可信度。還有研究者開發(fā)譜峰的預(yù)處理軟件，比如Katajamaa等［31］針對LCMS開發(fā)了MZmine軟件，該軟件主要用于代謝組資料的濾噪、譜峰匹配和標(biāo)準(zhǔn)化等預(yù)處理。

　　2.2  數(shù)據(jù)分析  醫(yī)學(xué)中的代謝組研究常常需要對疾病機(jī)制或治療相關(guān)的代謝標(biāo)志物進(jìn)行研究，常用的分析方法有PCA、t檢驗和方差分析等。如Coen等［32］應(yīng)用PCA方法對乙酰氨基酚肝毒性的代謝組資料進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該肝毒性可能與肝臟線粒體利用丙酮酸鹽和脂肪酸β氧化功能下降有關(guān)；Jansen等［33］還介紹了一種權(quán)重PCA方法處理代謝組資料；Smilde等［34］提出了一種基于方差分析的同時成分分析（ANOVAsimultaneous component analysis， ASCA）方法處理代謝組數(shù)據(jù)。在疾病的診斷研究方面常常應(yīng)用判別分析，比如應(yīng)用代謝組資料對患者進(jìn)行某病的是與否判別等。常用的方法有類模擬軟獨立建模（soft independent modeling of class analogy， SIMCA）、偏最小二乘法判別分析和人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)（artificial neural networks， ANN）等，比如Odunsi等［35］使用1HNMR研究上皮卵巢癌。選擇38名上皮卵巢癌病人，12名良性卵巢囊腫和53名健康婦女，應(yīng)用PCA方法降維數(shù)據(jù)和SIMCA方法進(jìn)行模式識別，結(jié)果分析判斷的準(zhǔn)確率為97%.Wang等［36］應(yīng)用LCMS技術(shù)研究2型糖尿病的血漿代謝譜，應(yīng)用PCA和偏最小二乘法顯著性分析（partial least squares discriminant analysis， PLSDA）方法能成功地將糖尿病人和對照正常人區(qū)分開來，為臨床診斷提供了參考。Bundy等［37］選擇了6種蠟樣芽胞桿菌，其中3種為實驗室使用的無毒的菌株，另3種為從腦膜炎患者分離的有毒的菌株，應(yīng)用核磁共振方法進(jìn)行代謝組學(xué)研究，采用主成分分析和權(quán)威的判別分析（canonical discriminant analysis， CDA）方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)判別分析能正確地將有毒、無毒菌株分開。Taylor等［38］使用433種代謝物資料，應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法建立數(shù)學(xué)模型，該模型能成功地對植物的基因型進(jìn)行判別分析。

　　3  代謝組技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

　　3.1  在疾病機(jī)制研究中的應(yīng)用  目前代謝組在疾病機(jī)制研究中的應(yīng)用還不多，主要應(yīng)用于腫瘤、遺傳病和少數(shù)幾種常見病之中。如Akira等［39］應(yīng)用NMR研究高血壓大鼠與正常大鼠尿的代謝譜差異，應(yīng)用PCA的方法進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛磺酸、肌酸及一些未鑒定的代謝物存在明顯的差異。Pears等［40］應(yīng)用NMR結(jié)合統(tǒng)計學(xué)的模式識別方法，研究Cln3基因敲除的巴藤病小鼠動物模型腦組織的代謝組變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷氨酸含量增加、γ氨基丁酸（γaminobutyric acid， GABA）下降，提示在谷氨酸/谷酰胺與GABA之間存在神經(jīng)遞質(zhì)循環(huán)的不足，這些變化代表了Cln3小鼠表型出現(xiàn)前的生化變化。Ippolito等［41］為了研究預(yù)后不良前列腺癌的特征，首先分析原發(fā)性前列腺癌及細(xì)胞株的基因表達(dá)譜資料，獲得446條高表達(dá)的基因，應(yīng)用這些基因結(jié)合代謝組學(xué)研究前列腺癌的代謝途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良前列腺癌存在谷氨酸脫羧酶等一些特征性代謝途徑。為了更好地應(yīng)用代謝組資料進(jìn)行疾病的機(jī)制研究，一些研究者將代謝組技術(shù)和其他技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行疾病機(jī)制的探索研究，如Stentiford等［42］應(yīng)用代謝組結(jié)合蛋白質(zhì)組和組織病理學(xué)方法研究肝癌的發(fā)病機(jī)制等。

　　3.2  在疾病診斷中的應(yīng)用  由于代謝組監(jiān)測是一種快速和無損傷的方法，在疾病診斷方面的研究開展相對較多，如Brindle等［43］應(yīng)用NMR技術(shù)研究冠心病患者血清的代謝組變化，PLSDA模式識別方法不僅能對冠心病進(jìn)行有無的診斷，而且還能判斷病情的輕重。Yang等［44］以毛細(xì)管氣相色譜結(jié)合模式識別方法研究2型糖尿病血清代謝組的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清脂肪酸譜能有效地將2型糖尿病和正常人區(qū)分開，模式識別方法提高了診斷的敏感性。Wishart［45］還將代謝組方法應(yīng)用于器官移植中監(jiān)測排斥反應(yīng)，在器官移植前后監(jiān)測血清肌酸酐的代謝產(chǎn)物，認(rèn)為代謝組可能成為器官移植生存能力和排斥反應(yīng)的理想監(jiān)測工具。最近代謝組學(xué)技術(shù)還應(yīng)用于艾滋病的研究中，如Hewer等［46］應(yīng)用1HNMR檢測患者血清的代謝譜，結(jié)合模式識別方法，發(fā)現(xiàn)血清的代謝譜能夠?qū)?a href="http://thedailypurge.net/jibing/aizibing/" target="_blank" title="艾滋病" class="hotLink">艾滋病陽性和陰性的患者區(qū)分開來。隨著研究的深入，代謝組技術(shù)必將應(yīng)用于更多的疾病研究之中。

　　3.3  在藥理學(xué)研究中的應(yīng)用  代謝組在藥理學(xué)方面的研究，主要集中于毒理學(xué)研究，如Kleno等［47］為了研究肼苯噠嗪誘導(dǎo)的肝毒性，選擇肝臟樣本，應(yīng)用NMR技術(shù)研究血清樣本代謝譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肼苯噠嗪引起了代謝物的明顯變化，主要與葡萄糖、脂肪、氧化應(yīng)激代謝相關(guān)。Heijne等［48］將溴苯誘導(dǎo)的肝炎大鼠血漿和尿液的代謝組資料結(jié)合大鼠的肝臟的基因表達(dá)譜資料分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組和代謝組結(jié)合能提高肝毒性檢測的敏感性。Coen等［49］為了鑒定撲熱息痛肝毒性引起的生化變化，進(jìn)行了肝組織的基因表達(dá)譜和肝組織及其提取物和血漿代謝組研究，從生化途徑對3種資料進(jìn)行分析，在完整肝組織中，肝葡萄糖和肝糖原下降，血漿中的脂肪成分丙酮酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽增加，水提物中丙氨酸、乳酸鹽增加。整合這些資料提示肝臟的糖酵解率增加，代謝組研究結(jié)果和基因表達(dá)譜的變化是一致的，主要涉及脂肪和能量代謝，兩種技術(shù)相結(jié)合起到互補(bǔ)的作用。

　　4  代謝組學(xué)在中西醫(yī)結(jié)合研究中的應(yīng)用展望

　　由于代謝組技術(shù)的一些優(yōu)勢和特點，目前代謝組已在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中開展了一些研究，并取得了一系列的成績。因此中西醫(yī)結(jié)合也應(yīng)積極應(yīng)用代謝組技術(shù)開展證候、方藥及針灸等方面的研究。2005和2006年度國家自然科學(xué)基金開始對該方向進(jìn)行了資助，主要集中在腎虛、腎陽虛、脾虛及虛實證等少數(shù)幾個項目。目前中醫(yī)藥應(yīng)用代謝組技術(shù)研究的報道還極少，相信隨著研究的深入，代謝組技術(shù)必將廣泛地應(yīng)用于中西醫(yī)結(jié)合研究中。另外，盡管代謝組是一種高通量的研究方法，但是由于代謝組關(guān)注的是小分子的代謝物，所以如果缺乏與基因組等知識的聯(lián)系，代謝組資料是很難解釋的。將代謝組與基因組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行結(jié)合研究也引起眾多學(xué)者的注意［50， 51］，因此中西醫(yī)結(jié)合也應(yīng)積極地將代謝組與基因組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行結(jié)合研究，即站在系統(tǒng)生物學(xué)的高度進(jìn)行研究。

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