【關鍵詞】  代謝組學； 中西醫(yī)結合； 醫(yī)學； 綜述

　　代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后發(fā)展起來的一種研究生物系統(tǒng)的組學方法。它是英國Nicholson教授及其同事于1999年正式提出的［1］。代謝組指的是“一個細胞、組織或器官中，所有代謝組分的集合，尤其指小分子物質”，而代謝組學則是一門“在新陳代謝的動態(tài)過程中，系統(tǒng)研究代謝產物的變化規(guī)律，揭示機體生命活動代謝本質”的科學［2］，它所關注的是相對分子質量為1 000以下的小分子。近年來代謝組研究已引起眾多研究者的注意，代謝組學與基因組學和蛋白質組學不同，基因組學和蛋白質組學告訴你可能發(fā)生什么，而代謝組學則告訴你已經發(fā)生了什么；還有研究者認為代謝組學是“組學”研究的終端［3］。為更好地將代謝組技術應用于中西醫(yī)結合研究中，本文根據(jù)近年來國外的相關資料，對代謝組學的實驗技術、分析技術及其在現(xiàn)代醫(yī)學中的應用現(xiàn)狀進行了綜述，同時對代謝組學在中西醫(yī)結合研究中的發(fā)展趨勢進行了展望。

　　1  代謝組學的實驗技術

　　1.1  代謝組學研究的常用技術  代謝組學研究常用核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）和質譜聯(lián)用技術，比如氣相色譜質譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer， GCMS）和液相色譜質譜聯(lián)用儀（liquid chromatographymass spectrometer， LCMS）等［4］。核磁共振光譜分析法是目前代謝組學研究應用最廣泛的方法，NMR的優(yōu)勢在于對樣品無破壞性，樣品處理簡單，無需分離過程；缺點是靈敏度低，很難同時測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產物，所需硬件的投資也較大。目前常用的是1DNMR，比如Brindle等［5］應用NMR研究高血壓患者血清的代謝譜特征；Lehnhardt等［6］應用NMR研究原發(fā)性和繼發(fā)性腦腫瘤的代謝譜差異等。1DNMR光譜的信息量大，但不可避免地存在峰圖的重疊，影響了隨后的分析，而2DNMR大大地改善了1DNMR峰圖的質量［7］，一些研究者開始應用2DNMR開展代謝組研究，如Choi等［8］為了研究被煙草花葉病毒感染煙草的代謝譜變化，應用2DNMR方法，結果發(fā)現(xiàn)5綠原酸等代謝物明顯增多。氣相色譜質譜聯(lián)用是當前最為活躍的聯(lián)用技術，一般供試物經GC分離為單一組分，按其不同保留時間，與載氣同時流出色譜柱，再經接口，進入質譜儀，然后可通過EI或其他方法產生一定的MS圖譜。GCMS有很好的分離效率，可由計算機對MS圖譜進行化合物數(shù)據(jù)庫的自動檢索核對，有利于迅速鑒識樣品。缺點是需要對樣品進行衍生化預處理，這一步驟額外費時，甚至引起樣品的變化；衍生化預處理限制了GCMS的應用范圍，無法分析熱不穩(wěn)定性的物質和分子量較大的代謝產物。如A等［9］針對GCMS的代謝組研究，應用多元統(tǒng)計方法對人血漿的提取和衍生化預處理方法進行了研究。液相色譜質譜聯(lián)用主要是高效液相色譜質譜（high performance liquid chromatographymass spectrometry， HPLCMS）聯(lián)用，HPLCMS進樣前不需進行衍生化處理，適合那些不穩(wěn)定、不易衍生化、不易揮發(fā)和分子量較大的化合物。缺點是分離效率不高，分析的時間相對較長；沒有化合物數(shù)據(jù)庫可供檢索和比對，樣品的鑒別還需進一步的分析［10］。如Yang等［11］使用LCMS方法結合主成分分析（principle component analysis， PCA）方法，比較肝炎、肝硬化與肝癌病人的尿液代謝譜的差異，結果發(fā)現(xiàn)一組尿代謝物與肝癌的相關性優(yōu)于傳統(tǒng)單一的甲胎蛋白。無論NMR、色譜和質譜都有各自的優(yōu)缺點，為了充分發(fā)揮各種技術的優(yōu)勢，有研究者將三種技術聯(lián)合應用于代謝組的研究。如Lenz等［12］應用1HNMR和HPLCTOFMSMS技術相結合研究慶大霉素的腎毒性尿液的內源性的代謝物變化，結果發(fā)現(xiàn)葡萄糖增加，三甲胺N氧化物（trimethylamine noxide， TMAO）降低等變化特點。

　　1.2  代謝組學研究的新技術  微量樣本是研究中經常面對的難題，而毛細管電泳質譜（capillary electrophoresismass spectrometry， CEMS）所需樣品量少，已廣泛地應用于代謝組的研究中，如Sato等［13］選擇了CEMS進行了水稻葉的代謝物檢測，成功地檢測了88種代謝物，這些代謝物涉及到醣酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、光呼吸作用和氨基酸的生物合成等。近年來為了監(jiān)測活體動物特定組織區(qū)域內代謝物的動態(tài)變化，研究者將微透析（microdialysis）技術引入了代謝組的研究，如Price等［14］應用微透析結合NMR比較了SD大鼠各組織在局部缺血狀態(tài)下的代謝情況。作者提出微量滲析技術和NMR相結合是代謝組研究的強有力工具?？梢姶x組同其他實驗技術一樣，有一個不斷完善的過程，一些研究者正致力于代謝組實驗技術的研究。

　　1.3  代謝組的研究材料  代謝組研究的樣本包括生物液體和組織，由于血漿和尿液收集簡單、易于長期檢測和包含大量的代謝信息，已經成為代謝組研究常用的標本；唾液也逐漸成為代謝組研究的另一種生物液體樣本，如Ramadan等［15］選擇了150個健康男性和女性，取唾液、血漿和尿液，應用1HNMR研究不同性別之間的代謝物差異等。此外還有應用腦脊液進行代謝組研究的報道，如Coen等［16］應用NMR研究細菌、真菌、病毒性腦膜炎腦脊液的代謝組變化，進行腦膜炎的代謝組臨床診斷的探索研究。血漿或尿液代謝物為全身各細胞、組織、器官代謝的分泌物，但是血漿或尿液只能代表生物體的平均代謝狀態(tài)或代謝組“整體模式”，不能獲得具體組織的代謝狀態(tài)。組織代謝研究提供了局部的代謝信息，而一些疾病本身可能就只影響了局部的代謝，如Viant等［17］研究早期腦外傷動物模型大腦組織與血漿的代謝物變化，結果在大腦組織有氧化應激（比如維生素C）興奮性中毒（比如谷氨酸）等代謝紊亂，而血漿中并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化，因此組織代謝的研究具有重要的意義。目前組織標本研究還不是很多，主要有肝、大腦皮層和小腦等，肝組織主要用于一些毒理學研究，如Azmi等［18］應用NMR技術，采集肝組織樣本研究肝毒性的代謝組變化等。大腦皮層、小腦組織主要用于神經系統(tǒng)疾病的研究，如Griffin等［19］應用NMR研究脊髓小腦性共濟失調動物模型小腦、大腦的提取物的代謝譜變化，結果發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺增加，而γ氨基丁酸、膽堿、磷酸膽堿和乳酸鹽下降等特征。

　　1.4  代謝組研究的影響因素  充分了解代謝組研究的影響因素是應用好代謝組技術開展醫(yī)學研究的前提，目前研究者們已經注意到了代謝組研究的影響因素［20］，除了實驗技術本身對代謝組研究的影響外，還有如樣品制備（抽提溶劑和溫度等）、儀器性能和數(shù)據(jù)分析方法等。不同生理狀態(tài)對代謝組的影響也引起了研究者的重視，比如性別、年齡、飲食、晝夜變化、文化等，因為這是代謝組技術在臨床應用的關鍵問題［21］。如Stanley［22］等為了探索不同性別間的代謝物差異，選擇了NMR結合化學計量方法研究不同性別Wistar大鼠尿液的代謝譜，結果發(fā)現(xiàn)羥苯基丙酸等代謝物存在明顯的性別差異；Kochhar等［23］選擇了150名健康人，應用NMR方法研究不同性別人血清和尿液的代謝譜差異，結果發(fā)現(xiàn)女性脂類的合成高于男性，男性的蛋白質轉換多于女性等差異。Bollard等［24］還綜述了不同生理狀態(tài)下的動物尿的代謝物特征，尤其在不同個體之間、性別、年齡、飲食、物種、品系、激素狀態(tài)、壓力及晝夜變化等，發(fā)現(xiàn)不同的生理狀態(tài)對代謝組有明顯的影響。Lenz等［25］收集了給予標準飲食的12名健康男性相隔14 d的血漿和尿液進行NMR檢測，應用PCA進行數(shù)據(jù)分析，結果發(fā)現(xiàn)血漿的差異很小，但在尿液中存在很大的個體差異，同時發(fā)現(xiàn)所有受試者代謝譜存在晝夜變化規(guī)律。Lenz等［26］還比較了不同國家之間人群的代謝譜的差異情況，選擇單身的受試者，不進行飲食限制，收集晨尿，應用NMR進行分析，使用PCA分析數(shù)據(jù)，結果發(fā)現(xiàn)一些有統(tǒng)計學意義的差異，研究表明內源性尿代謝譜受到文化、飲食的嚴重影響，因此在疾病或治療標志物的篩選中需要特別注意這些影響因素，此外還需結合數(shù)學的方法以排除這些影響因素。

　　2  代謝組的分析技術

　　2.1  譜峰的預處理  譜峰的預處理對代謝組的后期分析有較大的影響，質譜峰的預處理包括背景扣除、濾噪、保留時間校正、譜峰匹配和歸一化或標準化等。NMR譜峰的預處理包括背景扣除、濾噪、歸一化或標準化等。一些學者正對譜峰預處理的方法進行研究，比如針對1HNMR原始光譜資料，Stoyanova等［27］介紹了一種基于時間窗口的自動校正譜峰的方法；WebbRobertson等［28］就對譜峰整合和歸一化方法進行了研究。此外樣品的分析過程中不可避免地會出現(xiàn)譜峰漂移，F(xiàn)orshed等［29］比較了bucketing和PLF兩種最近發(fā)展的NMR峰位校正法，并應用實例對兩種方法進行了比較。氣或液質聯(lián)用技術，通過常規(guī)的重疊峰析法后，能分離300多種代謝物，但該方法耗時而且不能自動化。Jonsson等［30］發(fā)展了一種半自動的逐級多元曲線分辨處理質譜數(shù)據(jù)的方法，該方法已經應用于不同發(fā)育時間植物葉的代謝物研究，結果表明該法和常規(guī)的重疊峰析法具有類似的可信度。還有研究者開發(fā)譜峰的預處理軟件，比如Katajamaa等［31］針對LCMS開發(fā)了MZmine軟件，該軟件主要用于代謝組資料的濾噪、譜峰匹配和標準化等預處理。

　　2.2  數(shù)據(jù)分析  醫(yī)學中的代謝組研究常常需要對疾病機制或治療相關的代謝標志物進行研究，常用的分析方法有PCA、t檢驗和方差分析等。如Coen等［32］應用PCA方法對乙酰氨基酚肝毒性的代謝組資料進行分析，結果發(fā)現(xiàn)該肝毒性可能與肝臟線粒體利用丙酮酸鹽和脂肪酸β氧化功能下降有關；Jansen等［33］還介紹了一種權重PCA方法處理代謝組資料；Smilde等［34］提出了一種基于方差分析的同時成分分析（ANOVAsimultaneous component analysis， ASCA）方法處理代謝組數(shù)據(jù)。在疾病的診斷研究方面常常應用判別分析，比如應用代謝組資料對患者進行某病的是與否判別等。常用的方法有類模擬軟獨立建模（soft independent modeling of class analogy， SIMCA）、偏最小二乘法判別分析和人工神經元網絡（artificial neural networks， ANN）等，比如Odunsi等［35］使用1HNMR研究上皮卵巢癌。選擇38名上皮卵巢癌病人，12名良性卵巢囊腫和53名健康婦女，應用PCA方法降維數(shù)據(jù)和SIMCA方法進行模式識別，結果分析判斷的準確率為97%.Wang等［36］應用LCMS技術研究2型糖尿病的血漿代謝譜，應用PCA和偏最小二乘法顯著性分析（partial least squares discriminant analysis， PLSDA）方法能成功地將糖尿病人和對照正常人區(qū)分開來，為臨床診斷提供了參考。Bundy等［37］選擇了6種蠟樣芽胞桿菌，其中3種為實驗室使用的無毒的菌株，另3種為從腦膜炎患者分離的有毒的菌株，應用核磁共振方法進行代謝組學研究，采用主成分分析和權威的判別分析（canonical discriminant analysis， CDA）方法，結果發(fā)現(xiàn)判別分析能正確地將有毒、無毒菌株分開。Taylor等［38］使用433種代謝物資料，應用人工神經網絡的方法建立數(shù)學模型，該模型能成功地對植物的基因型進行判別分析。

　　3  代謝組技術在現(xiàn)代醫(yī)學研究中的應用

　　3.1  在疾病機制研究中的應用  目前代謝組在疾病機制研究中的應用還不多，主要應用于腫瘤、遺傳病和少數(shù)幾種常見病之中。如Akira等［39］應用NMR研究高血壓大鼠與正常大鼠尿的代謝譜差異，應用PCA的方法進行分析，結果發(fā)現(xiàn)?；撬?、肌酸及一些未鑒定的代謝物存在明顯的差異。Pears等［40］應用NMR結合統(tǒng)計學的模式識別方法，研究Cln3基因敲除的巴藤病小鼠動物模型腦組織的代謝組變化，結果發(fā)現(xiàn)谷氨酸含量增加、γ氨基丁酸（γaminobutyric acid， GABA）下降，提示在谷氨酸/谷酰胺與GABA之間存在神經遞質循環(huán)的不足，這些變化代表了Cln3小鼠表型出現(xiàn)前的生化變化。Ippolito等［41］為了研究預后不良前列腺癌的特征，首先分析原發(fā)性前列腺癌及細胞株的基因表達譜資料，獲得446條高表達的基因，應用這些基因結合代謝組學研究前列腺癌的代謝途徑，結果發(fā)現(xiàn)預后不良前列腺癌存在谷氨酸脫羧酶等一些特征性代謝途徑。為了更好地應用代謝組資料進行疾病的機制研究，一些研究者將代謝組技術和其他技術相結合進行疾病機制的探索研究，如Stentiford等［42］應用代謝組結合蛋白質組和組織病理學方法研究肝癌的發(fā)病機制等。

　　3.2  在疾病診斷中的應用  由于代謝組監(jiān)測是一種快速和無損傷的方法，在疾病診斷方面的研究開展相對較多，如Brindle等［43］應用NMR技術研究冠心病患者血清的代謝組變化，PLSDA模式識別方法不僅能對冠心病進行有無的診斷，而且還能判斷病情的輕重。Yang等［44］以毛細管氣相色譜結合模式識別方法研究2型糖尿病血清代謝組的變化，結果發(fā)現(xiàn)血清脂肪酸譜能有效地將2型糖尿病和正常人區(qū)分開，模式識別方法提高了診斷的敏感性。Wishart［45］還將代謝組方法應用于器官移植中監(jiān)測排斥反應，在器官移植前后監(jiān)測血清肌酸酐的代謝產物，認為代謝組可能成為器官移植生存能力和排斥反應的理想監(jiān)測工具。最近代謝組學技術還應用于艾滋病的研究中，如Hewer等［46］應用1HNMR檢測患者血清的代謝譜，結合模式識別方法，發(fā)現(xiàn)血清的代謝譜能夠將艾滋病陽性和陰性的患者區(qū)分開來。隨著研究的深入，代謝組技術必將應用于更多的疾病研究之中。

　　3.3  在藥理學研究中的應用  代謝組在藥理學方面的研究，主要集中于毒理學研究，如Kleno等［47］為了研究肼苯噠嗪誘導的肝毒性，選擇肝臟樣本，應用NMR技術研究血清樣本代謝譜，結果發(fā)現(xiàn)肼苯噠嗪引起了代謝物的明顯變化，主要與葡萄糖、脂肪、氧化應激代謝相關。Heijne等［48］將溴苯誘導的肝炎大鼠血漿和尿液的代謝組資料結合大鼠的肝臟的基因表達譜資料分析，結果發(fā)現(xiàn)轉錄組和代謝組結合能提高肝毒性檢測的敏感性。Coen等［49］為了鑒定撲熱息痛肝毒性引起的生化變化，進行了肝組織的基因表達譜和肝組織及其提取物和血漿代謝組研究，從生化途徑對3種資料進行分析，在完整肝組織中，肝葡萄糖和肝糖原下降，血漿中的脂肪成分丙酮酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽增加，水提物中丙氨酸、乳酸鹽增加。整合這些資料提示肝臟的糖酵解率增加，代謝組研究結果和基因表達譜的變化是一致的，主要涉及脂肪和能量代謝，兩種技術相結合起到互補的作用。

　　4  代謝組學在中西醫(yī)結合研究中的應用展望

　　由于代謝組技術的一些優(yōu)勢和特點，目前代謝組已在現(xiàn)代醫(yī)學中開展了一些研究，并取得了一系列的成績。因此中西醫(yī)結合也應積極應用代謝組技術開展證候、方藥及針灸等方面的研究。2005和2006年度國家自然科學基金開始對該方向進行了資助，主要集中在腎虛、腎陽虛、脾虛及虛實證等少數(shù)幾個項目。目前中醫(yī)藥應用代謝組技術研究的報道還極少，相信隨著研究的深入，代謝組技術必將廣泛地應用于中西醫(yī)結合研究中。另外，盡管代謝組是一種高通量的研究方法，但是由于代謝組關注的是小分子的代謝物，所以如果缺乏與基因組等知識的聯(lián)系，代謝組資料是很難解釋的。將代謝組與基因組和蛋白質組進行結合研究也引起眾多學者的注意［50， 51］，因此中西醫(yī)結合也應積極地將代謝組與基因組和蛋白質組進行結合研究，即站在系統(tǒng)生物學的高度進行研究。

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