本章重點(diǎn):

　　掌握：DNA克隆概念，限制性內(nèi)切酶的定義及其特點(diǎn)，基因載體的種類。重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程，目的基因獲取的方法，外源基因與載體的連接方式，重組DNA分子導(dǎo)入受體菌的方式，重組體篩選的方法。

　　熟悉：基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的概念，目的基因表達(dá)體系的種類及其特點(diǎn)

　　了解：自然界基因轉(zhuǎn)移的方式：接合作用、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)作用、轉(zhuǎn)座；重組有兩種類型，即位點(diǎn)特異性的重組和同源重組

　　本章難點(diǎn)

　　兩種類型基因重組的機(jī)理；限制性內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)，基因載體的種類；重組DNA技術(shù)的基本環(huán)節(jié)中，目的基因的獲取方法，外源基因與載體連接的方法，重組DNA導(dǎo)入受體菌的方法，重組體的篩選方法，以及原核和真核表達(dá)體系的優(yōu)缺點(diǎn)比較

　　基本要點(diǎn)

　　一、自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組

　　自然界不同物種或個(gè)體之間的基因轉(zhuǎn)移和重組是經(jīng)常發(fā)生的，它是基因變異和物種進(jìn)化的基礎(chǔ)。自然界的基因轉(zhuǎn)移的方式有：

　　接合作用：當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA 就可從一個(gè)細(xì)胞(細(xì)菌)轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞(細(xì)菌)，這種類型的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation )。

　　轉(zhuǎn)化作用(transformation) 通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。

　　轉(zhuǎn)導(dǎo)作用：當(dāng)病毒從被感染的(供體)細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一(受體)細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。

　　轉(zhuǎn)座：大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置。這些可移動(dòng)的DNA 序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。由插人序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition )。

　　基因重組：在接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)座過(guò)程中，不同DNA分子間發(fā)生的共價(jià)連接稱基因重組?；蛑亟M包括位點(diǎn)特異性的重組和同源重組兩種類型。有整合酶催化的在兩個(gè)DNA序列特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合，產(chǎn)生位點(diǎn)特異的重組。特異重組依賴特異的DNA序列，如λ噬菌體的整和酶可識(shí)別噬菌體DNA和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)，并進(jìn)行選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶識(shí)別整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列等。另外有發(fā)生在同源序列間的同源重組，又稱基本重組。同源重組依賴兩分子間序列的相同或相似性，將外源DNA整合進(jìn)宿主染色體。

　　二、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念

　　1．DNA克隆(DNA cloning) 就是應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外把目的基因與載體DNA結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的DNA分子一一復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆。由于早期研究是從較大的染色體分離、擴(kuò)增特異性基因，因此DNA克隆又稱基因克隆(gene cloning )。

　　2．工具酶 在重組DNA技術(shù)即基因工程技術(shù)中需應(yīng)用某些基本酶類進(jìn)行基因操作，稱為工具酶。常用的工具酶包括如DNA聚合酶Ⅰ、DNA連接酶、末端轉(zhuǎn)移酶、反轉(zhuǎn)錄酶、多聚核苷酸激酶，而限制性核酸內(nèi)切酶特別重要，應(yīng)用最廣。

　　限制性內(nèi)切核酸酶(restriction endonuclease) 是能夠識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切核酸酶存在于細(xì)菌體內(nèi)，與相伴存在的甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制－修飾體系，限制外源DNA、保護(hù)自身DNA，對(duì)細(xì)菌遺傳性狀的穩(wěn)定遺傳具有重要意義。目前發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶有1800種以上。限制性內(nèi)切核酸酶分為三類。重組DNA技術(shù)中常用的限制性內(nèi)切核酸酶為Ⅱ類酶，例如，EcoRI、BamH I等就屬于這類酶。大部分Ⅱ類酶識(shí)別DNA位點(diǎn)的核苷酸序列呈二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱，通常稱這種特殊的結(jié)構(gòu)順序?yàn)榛匚慕Y(jié)構(gòu)(Palindrome)。所有限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA均產(chǎn)生含5'磷酸基和3'羥基基團(tuán)的末端。限制性內(nèi)切核酸酶的特點(diǎn)：①識(shí)別DNA的特異序列并切割；②不同的酶識(shí)別核苷酸序列往往包含4個(gè)到6個(gè)核苷酸；③不同的酶切割DNA頻率不同；④可產(chǎn)生粘性或鈍性未端；帶有相同類型的粘性末端或鈍性末端的DNA都可以再相互連接。

　　3．目的基因 基因工程中常為分離、獲得某一感興趣的基因或DNA序列，或?yàn)榈玫礁信d趣的基因的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物，這種感興趣的基因或DNA序列稱為目的基因。目的基因可來(lái)自cDNA和基因組DNA，cDNA(complementary DNA )是指以mRNA或病毒RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化合成互補(bǔ)單鏈DNA，再聚合生成的雙鏈cDNA；基因組DNA(genomic DNA)則指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體全套遺傳信息的所有DNA 序列。

　　4．基因載體 基因載體也稱克隆載體，是指用以攜帶外源目的基因，實(shí)現(xiàn)外源DNA克隆及表達(dá)為有意義蛋白質(zhì)而利用的DNA分子。能使插入的外源DNA序列可被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽鏈而專門設(shè)計(jì)的基因載體又稱表達(dá)載體。常用基因載體包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA等。理想載體有獨(dú)立復(fù)制能力，能夠利用宿主酶系轉(zhuǎn)錄和翻譯，有多種限制性內(nèi)切酶單一切口及一定篩選標(biāo)記，如質(zhì)粒的抗藥性基因

　?。?）質(zhì)粒(plasmid) 存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。能在宿主細(xì)胞獨(dú)立自主地進(jìn)行復(fù)制，會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀，如對(duì)抗生素或重金屬的抗性等。質(zhì)粒賦予細(xì)菌的表型可識(shí)別質(zhì)粒的存在，是篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)菌的根據(jù)。

　?。?）噬菌體DNA 常用作基因載體的噬菌體DNA有λ噬菌體、M13噬菌體，經(jīng)M13噬菌體改造的載體含不同位置的克隆位點(diǎn)，可接受不同限制性內(nèi)切酶切片段。

　?。?）另外還有可插入大片段外源基因的柯斯質(zhì)粒載體、酵母人工染色體載體，用于真核基因表達(dá)的腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。

　　三、重組DNA技術(shù)基本原理

　　DNA克隆過(guò)程包括:目的基因的獲取，基因載體的選擇與構(gòu)建，目的基因與載體的拼接，重組DNA分子導(dǎo)人受體細(xì)胞，篩選并無(wú)性繁殖含重組分子的受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化子)。

　　目的基因的獲取常用的方法：化學(xué)合成法、基因組DNA文庫(kù)、cDNA文庫(kù) 聚合酶鏈反應(yīng)

　　克隆載體的選擇和構(gòu)建：將外源DNA連到復(fù)制子上，外源DNA則可作為復(fù)制子的一部分在受體細(xì)胞中復(fù)制。這種復(fù)制子就是克隆載體。

　　外源基因與載體的連接：粘性末端連接包括同一限制酶切割位點(diǎn)連接和不同限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)連接；平端連接；同聚物加尾連接；人工接頭連接。

　　重組DNA導(dǎo)入受體菌：導(dǎo)入重組DNA分子的方法有轉(zhuǎn)化(transformation)、轉(zhuǎn)染(transfectim)和感染(infection)等。受體細(xì)胞為細(xì)菌時(shí)，常采用電穿擊法、熱擊法等。

　　重組體的篩選：根據(jù)載體體系、宿主細(xì)胞特性及外源基因在受體細(xì)胞表達(dá)情況不同，可采取直接選擇法和非直接選擇法。直接選擇法，指對(duì)載體攜帶某種或某些標(biāo)志基因和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法，其特點(diǎn)是直接測(cè)定基因或基因表型；抗藥性標(biāo)志選擇，標(biāo)志補(bǔ)救，分子雜交法； 免疫學(xué)方法不是直接鑒定基因，而是利用特異抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選，因此屬非直接選擇法。免疫學(xué)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，尤其適用于選擇不為宿主菌提供任何選擇標(biāo)志的基因。免疫學(xué)方法又可根據(jù)具體基因選擇操作過(guò)程不同，分為免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等。

　　克隆基因的表達(dá)：目的基因的表達(dá)體系的建立包括表達(dá)載體的構(gòu)建、受體細(xì)胞的建立及表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化等技術(shù)和策略。表達(dá)體系包括原核表達(dá)體系和真核表達(dá)體系兩類。E. coli是當(dāng)前采用最多的原核表達(dá)體系，其優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)方法單、迅速、經(jīng)濟(jì)而又適合大規(guī)模生產(chǎn)工藝，人們運(yùn)用E.coli表達(dá)外源基因已有20多年的經(jīng)驗(yàn)。在實(shí)際工作中，根據(jù)表達(dá)的基因不同，選擇不同的表達(dá)策略。E.coli表達(dá)體系在實(shí)際應(yīng)用中尚有一些不足之處：①由于缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制；②由于缺乏適當(dāng)?shù)姆g后加工機(jī)制；③表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體，欲使其具有活性尚需進(jìn)行復(fù)雜的復(fù)性處理；④很難在Ecol表達(dá)體系表達(dá)大量的可溶性蛋白。真核表達(dá)體系如酵母、昆蟲及哺乳類動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系顯示了較大優(yōu)越性。尤其是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞，不僅可表達(dá)克隆的cDNA，而且還可表達(dá)真核基因組DNA；哺乳類細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)通常總是被適當(dāng)修飾，而且表達(dá)的蛋白質(zhì)會(huì)恰當(dāng)?shù)胤植荚诩?xì)胞內(nèi)一定區(qū)域并積累。哺乳類動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的缺點(diǎn)是操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì)。常用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法有：磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及顯微注射等。當(dāng)前采用最多的哺乳類細(xì)胞是COS細(xì)胞(猿個(gè)猴腎細(xì)胞)和CHO細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)。

　　四、重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系

　　1990年，分子醫(yī)學(xué)(molecular medicine )的誕生及其在近幾年的發(fā)展正是重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)實(shí)踐相結(jié)合的結(jié)果。分子醫(yī)學(xué)包含的領(lǐng)域及內(nèi)容概括如下幾個(gè)方面。

　　1．疾病基因的發(fā)現(xiàn) 重組DNA技術(shù)的應(yīng)用使分子遺傳學(xué)家有可能根據(jù)基因定位，而不是它的功能來(lái)克隆一個(gè)基因。根據(jù)克隆基因的定位和性質(zhì)研究所提供的線索，可進(jìn)一步確定克隆的基因在分子遺傳病中的作用。因此，一個(gè)疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)不僅可導(dǎo)致新的遺傳病的發(fā)制圖或定位，并掌握其全部序列信息，人類則完全可能通過(guò)對(duì)候選基因的控制和改造，從根本上治療和防止遺傳病的發(fā)生和流行。

　　2．發(fā)展生物制藥 利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)。重組蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)是在功能研究、基因克隆基礎(chǔ)上，構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系表達(dá)有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽；再經(jīng)過(guò)科學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)和藥物審查，發(fā)展為新藥物。

　　3．遺傳病的預(yù)防 受累疾病基因克隆不僅為醫(yī)學(xué)家提供了重要工具，使他們能深入地認(rèn)識(shí)、理解一種遺傳病的發(fā)生機(jī)制，為尋求可能的治療途徑、預(yù)測(cè)療效提供了有力手段；更重要的是，利用這些成果進(jìn)行極有意義的產(chǎn)前診斷和癥候前診斷，而后通過(guò)診斷技巧與治療、預(yù)防能力的結(jié)合，從根本上杜絕遺傳性疾病的發(fā)生和流行。預(yù)防方法包括：產(chǎn)前診斷、攜帶者測(cè)試、癥候前診斷、遺傳病易感性分析。