檢驗(yàn)原理

金霉素是一種高效廣譜抗生素，對(duì)多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，常用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療。但其在動(dòng)物肉、奶、蛋等食品中的殘留嚴(yán)重威脅人體健康，能引起再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，低濃度的藥物殘留還會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性。歐盟、美國等許多國家已明確禁止CAP用于生產(chǎn)動(dòng)物源性食品，并制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。加入WTO后，農(nóng)、獸藥殘留日益成為各發(fā)達(dá)國家限制中國農(nóng)副產(chǎn)品出口的技術(shù)壁壘。2002年1月30日，歐盟委員會(huì)以從中國進(jìn)口的蝦仁中檢出金霉素為由，發(fā)布2002/69/EC決議，禁止中國動(dòng)物源性食品進(jìn)口，直接造成中國水產(chǎn)品出口6億多美元的經(jīng)濟(jì)損失。

金霉素等半抗原（分子量<1000Da）的檢測(cè)方法，通常采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）及高效液相色譜（HPLC）及氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）等方法。然而，這些方法需要較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間及相應(yīng)昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，主要被限制在實(shí)驗(yàn)室中使用。隨著人們對(duì)食品安全的日益重視和進(jìn)出口貿(mào)易的高速增長(zhǎng)，迫切需要一種能快速、穩(wěn)定地檢測(cè)農(nóng)、獸藥殘留的方法。膠體金免疫層析試條因其使用方便已被廣泛用于小分子物質(zhì)的診斷檢測(cè)，目前已經(jīng)開發(fā)出用于鏈霉素、磺胺嘧啶等農(nóng)、獸藥殘留檢測(cè)的試紙條。本實(shí)驗(yàn)開發(fā)了一種快速檢測(cè)金霉素殘留的免疫層析試紙條，具有靈敏度高，操作快捷，不需要附加設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，適用于加工企業(yè)對(duì)原輔材料驗(yàn)收，人員用藥，成品分析以及養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)投入品的檢測(cè)等工作。

材料與方法

1.1材料氯金酸（HauCl4·4H2O）、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000購于SIGMA公司；抗金霉素單克隆抗體（MAb），購于Biodesign公司（免疫原為KLH與金霉素的偶聯(lián)物，鼠源性）；水溶性碳二亞胺（EDC）、金霉素琥珀酸鈉鹽，購于Fluka公司；羊抗鼠IgG購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；金霉素ELISA檢測(cè)試劑盒購于EURO-DIOGNOSTICA公司；Bradford蛋白定量試劑盒購于Bio-Rad公司；BioJet XYZ3000型點(diǎn)膜儀購于美國BioDot公司；硝酸纖維素膜（NC）、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊購于Millipore公司。1.2膠體金的制備及抗金霉素Mab的金標(biāo)記膠體金顆粒的大小平均為30nm，參照文獻(xiàn)制備膠體金顆粒，在100ml去離子水中加入1%檸檬酸三鈉1ml，煮佛后迅速加入1%氯金酸1ml，繼續(xù)煮佛10min，冷卻后，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取已制備好的膠體金溶液100ml，用0.1mol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.0。邊攪拌邊加入抗金霉素MAb1.5mg，攪拌20min，再逐滴加入2ml25mg/ml聚乙二醇20000（PEG20000），攪拌15min。20000 r/min離心15min，棄上清液，加入10mlpH7.4PBS緩沖液（含0.4mg/mlPEG）清洗2次。將沉淀用5ml含2%BSA的PBS緩沖液（Ph7.4）溶解，用0.22μm無菌過濾器過濾后，4℃保存?zhèn)溆谩?.3樣品制備金霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品配制以甲醇配成100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)貯液，后以超純水稀釋成各濃度梯度。

肉類樣品預(yù)處理取10g均質(zhì)過的試樣，加入10mlPBS，37℃混合保溫90 min后，3000r/min離心20 min，收集上清液備用。

牛奶樣品預(yù)處理取5ml新鮮牛奶，放入離心管中，10℃3500r/m離心10 min，吸除上層的脂肪層，取去脂牛奶用PBS適當(dāng)稀釋后備用。

將上述試樣處理液與各種濃度的金霉素標(biāo)準(zhǔn)品按不同體積比混合成所需濃度的試樣。部分實(shí)際待測(cè)試樣的處理方法參考荷蘭EURO-DIAGNOSTICA金霉素檢測(cè)試劑盒產(chǎn)

品試樣處理方法。1.4金霉素全抗原的合成包被抗原為金霉素與BSA的偶聯(lián)物（CAP-BSA），其合成方法為活性酯法及疊氮法，參見文獻(xiàn)，其中活性酯法為：先將20mg氯毒素琥珀酸鹽、15mgEDC及30mgBSA混合溶于1ml Tris緩沖液中，0~4℃下避光攪拌1h，再加入5mgEDC，在0℃下攪拌反應(yīng)12h，靜置過夜后，后用Tris緩沖液透析3d。

將合成的CAP-BSA全抗原稀釋成100μg/ml（蛋白濃度），后做200~300nm波長(zhǎng)的紫外掃描，參照楊利國介紹的計(jì)算方法測(cè)算偶聯(lián)比，即CAP與載體蛋白BSA的摩爾比。其中BSA濃度以BRADFORD蛋白定量試測(cè)定。

用EURO-DIOGNOSTICA公司的ILISA試劑盒檢測(cè)金霉素濃度，操作方法參見產(chǎn)品說明書。在450nm波長(zhǎng)處測(cè)A值，計(jì)算抑制率：

抑制率=B/B0×100%B0為不含待測(cè)試樣中金霉素的吸光值，B為含待測(cè)試樣中金霉素吸光值。

1.5試紙條組裝用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的CAP-BSA及羊抗鼠IgG噴在NC膜上，分別作為檢測(cè)線（T）和控制線（C），在37℃烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標(biāo)記CAP單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。

試紙條組成為一個(gè)PVC背板，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用帶MARK膠帶繞背板覆蓋在樣品墊、膠體金結(jié)合墊及吸水墊上。用切割機(jī)將貼好的板切割成3mm寬的條，放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲(chǔ)存。

1.6檢測(cè)方法將CAP檢測(cè)試紙條帶MARK線的一端插入裝有待測(cè)試樣的容器中，使試樣溶液沿膜從下往上移動(dòng)。5min以后，即可判讀結(jié)果。

結(jié)果與討論

2.1檢測(cè)結(jié)果的判讀試紙條的組成如圖1所示。當(dāng)樣品墊端放入檢測(cè)試樣時(shí)，由于毛細(xì)作用液體向前移動(dòng)。到達(dá)T線時(shí)，試樣中的金霉素與固定在T線上的CAP-BSA復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗金霉素MAb-膠體金復(fù)合物，若試樣中金霉素濃度小于1ng/ml，則膠體金結(jié)合墊中的抗金霉素MAb-膠體金復(fù)合物與T線上CAP-BSA及C線上羊抗鼠IgG大量結(jié)合，T線呈色與c線相近，結(jié)果為陰性；若試樣中金霉素的濃度大于1ng/ml，則抗金霉素MAb-膠體金復(fù)合物基本上與檢測(cè)試樣中的金霉素結(jié)合，不能與T線上的CAP-BSA結(jié)合，因此T線將比c線淺很多或完全看不到線，而且試樣中金霉素濃度越高T線顯色越淺，結(jié)果為陽性。如檢測(cè)正確進(jìn)行的話，控制線總會(huì)顯示紅色線條。2.2CAP-BSA人工抗原合成本試紙條檢測(cè)線所用的包被抗原為CAP-BSA偶聯(lián)物，由本實(shí)驗(yàn)室人工合成。偶聯(lián)反應(yīng)后所得產(chǎn)物經(jīng)紫外光譜分析，參照文獻(xiàn)所介紹的方法計(jì)算其偶聯(lián)比率。多次實(shí)驗(yàn)所得抗原的偶聯(lián)比率在1：10~40左右，部分?jǐn)?shù)據(jù)見表1。由表1可以看出，BSA與CAP偶聯(lián)后最大吸收峰都發(fā)生藍(lán)移，可能是其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化及環(huán)境極性增大的原因。對(duì)金霉素與BSA的偶聯(lián)是否成功，還采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA檢測(cè)來判斷。按梯度稀CAP-BSA偶聯(lián)物，后由CAP-BSA與CAP標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金霉素抗體。

金霉素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)不同濃度CAP-BSA的抑制率，隨著CAP-BSA稀釋倍數(shù)的升高（CAP-BSA含量減少）酶標(biāo)金霉素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其的抑制率升高。即CAP-BSA與酶標(biāo)金霉素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金霉素抗體，表明抗原偶聯(lián)是成功的。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)CAP抗原的合成方法采用了活性酯法與疊氮法，并比較其對(duì)T線的影響。由于疊氮法合成的疊氮化合物為淡黃色物質(zhì)，干擾T線顯色，因此不適用作為檢測(cè)線的包被抗原。而活性酯法合成的偶聯(lián)物CAP-BSA1~3，以相同的BSA濃度包被T線，控制線都能與金標(biāo)記的CAP抗體反應(yīng)出現(xiàn)明顯的紅色線條，適合做包被抗原。并發(fā)現(xiàn)其不同結(jié)合比對(duì)檢測(cè)的靈敏度有一定影響，見試紙條的調(diào)試部分。

2.3試紙條的調(diào)試將不同半抗原結(jié)合比、不同濃度的CAP-BSA和不同A值的金霉素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物分別包被在硝酸纖維素膜和膠體金結(jié)合墊上，反復(fù)調(diào)試，使最終的靈敏度達(dá)到所需的要求。其用量如下：金霉素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物采用A值為40（噴量2μg/cm）的包被量，檢測(cè)線CAP-BSA用量為0.1mg/ml（噴量0.75μl/cm），控制線羊抗鼠IgG用量為1mg/ml（噴量0.75μl/cm）。調(diào)試結(jié)果表明采用不同pH值5、6、7、8、9、10的樣品墊對(duì)試劑條的靈敏度沒有產(chǎn)生明顯影響。將硝酸纖維素膜用各種不同配比的溶液做封閉，發(fā)現(xiàn)試劑條的C、T線顯色都變淺，但對(duì)靈敏度和特異性沒有明顯影響，所以最終制備試劑條時(shí)沒有采用封閉的方案。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，用同樣的C、T線濃度、抗體-膠體金復(fù)合物A值和同樣的包被量，采用12μm和5μm這兩種不同比例的蔗糖和海藻糖，會(huì)對(duì)膠體金復(fù)合物從膠體金結(jié)合墊上的釋放能力產(chǎn)生影響，在一定范圍內(nèi)，加入的蔗糖和海藻糖的比例越高，膠體金復(fù)合物釋放得越快。

采用半抗原偶聯(lián)率比較高的CAP-BSA做成的試劑條靈敏度更高，這可能同偶聯(lián)比率高的CAP-BSA與金霉素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)的能力更強(qiáng)有關(guān)。但過高的半抗原結(jié)合比并不符合C、T線顏色對(duì)比這種判斷，反而使靈敏度下降。本試紙條金霉素的最低檢測(cè)水平（LDL）的判斷標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)檢測(cè)線比控制線的顏色明顯淡時(shí)，試樣中金霉素的含量為1mg/ml。當(dāng)試樣中的CAP濃度大于5ng/ml時(shí)，檢測(cè)線完全消失；當(dāng)CAP濃度小于0.5ng/ml時(shí)，檢測(cè)線與控制線在肉眼下沒有明顯區(qū)別。本試紙條的LDL可達(dá)到1ng/ml。檢測(cè)限如再降低，容易出現(xiàn)假陰（陽）性的結(jié)果。由于其使用主要是在生產(chǎn)場(chǎng)所現(xiàn)場(chǎng)大批量初篩時(shí)定性檢測(cè)，此靈敏度可以滿足實(shí)際的篩選需要，如需可靠的定量結(jié)果還需在實(shí)驗(yàn)室里做ELISA、HPLC等進(jìn)一步檢測(cè)。

2.5檢測(cè)的特異性將金霉素琥珀酸鈉，甲砜霉素，磺胺二甲基嘧啶，四環(huán)素，青霉素，鏈霉素6種抗菌素溶于PBS（pH7.4，0.01mol/L），配成不同濃度，然后用試紙條檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，金霉素琥珀酸鈉及金霉素在低濃度下即不出現(xiàn)紅色T線。而后5者（類似物）即使在濃度大于100ng/ml時(shí)，也能見明顯的T線，可見與不同抗菌素的交叉反應(yīng)很低（因定性檢測(cè)不能給出交叉率的確切數(shù)值）。由于T線包被抗原是

以琥珀金霉素鈉鹽偶聯(lián)BSA而成，因此金霉素琥珀酸鈉與金霉素的這種交叉反應(yīng)是在意料之中的。因此免疫層析試紙條可以通過觀察試紙條上檢測(cè)線的有無及顏色變化進(jìn)行定性檢測(cè)，對(duì)金霉素具有較高的特異性。2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)用同一批次不同試紙條檢測(cè)同一樣品，及用不同批次試紙條測(cè)定同一樣品，其質(zhì)控線、測(cè)試線的顯色時(shí)間及顏色深淺和最終結(jié)果判讀基本相同。利用該試紙條對(duì)含不同濃度金霉素殘留的蝦肉提取液試樣進(jìn)行檢測(cè)并與ELISA的檢測(cè)結(jié)果比較，總共檢測(cè)50份（陽性30份，陰性20）。試紙條以1ng/ml為判斷限值，沒有出現(xiàn)假陽性及假陰性，檢測(cè)結(jié)果與ELISA結(jié)果完全相符。如把檢測(cè)限值再降低則易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，不能達(dá)到試紙條檢測(cè)穩(wěn)定性的要求。

免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。目前金標(biāo)記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測(cè)方式，如免疫滲濾試驗(yàn)和免疫層析試驗(yàn)等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個(gè)重要發(fā)展方向，是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測(cè)技術(shù)。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測(cè)（POCT）中得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測(cè)。目前已有些非臨床檢測(cè)的應(yīng)用，如毒素、藥殘留、環(huán)境監(jiān)測(cè)等。我們研制的金霉素膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條可用于飼料、水產(chǎn)類、牛奶等的檢測(cè)，最低檢測(cè)含量（LDL）達(dá)到1ng/ml。相對(duì)于目前使用ELISA方法檢測(cè)金霉素樣品至少需要24h，費(fèi)用約為300元/個(gè)，試紙條只需10min就可出結(jié)果，費(fèi)用低廉，而且不需要附加實(shí)驗(yàn)設(shè)備，能滿足養(yǎng)殖場(chǎng)所和加工企業(yè)對(duì)原輔材料、人員用藥及產(chǎn)品初篩等的檢測(cè)需要。但由于實(shí)驗(yàn)樣品來源有限，檢測(cè)試紙條的各種參數(shù)，需在擴(kuò)大樣品范圍與數(shù)量條件下做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

【主要質(zhì)量指標(biāo)】

金霉素含量：15%/20% 四環(huán)素含量：小于1.2%/1.6% 蛋白質(zhì)含量：20-50% 脂肪含量：2-4% 糖含量：小于2% 灰分：小于40% 水分含量：小于8% 重金屬含量：小于20ppm 砷鹽含量：小于2ppm 差向金霉素含量：小于0.9%/1.2% 酸堿度：5.0－7.5 粒度：250微米80%通過（粉狀）;250-850/90%通過（粒狀） 性狀：棕色至深棕色

【飼企用途】：

1. 本品為飼料添加劑抗生素。加在雛雞仔雞的飼料中可以促進(jìn)生 長(zhǎng)發(fā)育，縮短育成期，提高育成率。 2. 對(duì)金霉素敏感菌能起抑制作用，小劑量添加可以預(yù)防 疾病， 增大劑量可起治病作用。3. 低劑量添加即可達(dá)到促進(jìn)腸道吸收功能，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率。4. 本品是一種安全性高的抗菌素，只以低濃度添加就能產(chǎn)生效能，而擴(kuò)大18倍劑量也不產(chǎn)生毒副作用。長(zhǎng)期使用，長(zhǎng)期有效，不產(chǎn)生抗藥性。 效能：1. 飼用金霉素能促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育，提高飼料報(bào)酬率30%以 上，對(duì)0-8周齡雛雞可提高育雛率6.23%，增重11．94%，可預(yù) 防金霉素敏感菌引起的疾病。2. 飼用金霉素對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性菌、其它巴氏桿菌、結(jié)核 桿菌等均有較強(qiáng)的抑制作用。對(duì)防治和治療雞白痢、傷寒、副傷 寒、霍亂、球蟲病、肺炎、腸炎、喘氣病及魚、蝦、蚌類的細(xì)菌 性疫病尤為顯著。本品與土霉素同屬四環(huán)類廣譜抗生素，但金霉 素促進(jìn)生長(zhǎng)和滅殺細(xì)菌能力大大優(yōu)于土霉素。