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    高效液相色譜儀的使用和原理

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    高效液相色譜法(HPLC)是目前應(yīng)用廣泛的分離、分析、純化有機化合物(包括能通過化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C化合物的無機物)的有效方法之一。 在已知的有機化合物中,約有80%能用高效液相色譜法分離、分析,而且由于此法條件溫和,不破壞樣品,因此特別適合高沸點、難氣化揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的有機化合物和生命物質(zhì)。

    HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部位。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、與柱或保護住、柱溫控制器等,現(xiàn)代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng),進行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。

    目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters 公司、Agilent 公司(原HP公司)、島津公司等,國內(nèi)有上海伍豐科學(xué)儀器有限公司,上海禾工科學(xué)儀器有限公司,大連依利特公司、北京創(chuàng)新通恒、北京溫分等。

    一、輸液泵

    1.泵的構(gòu)造和性能輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能:

    ①流量穩(wěn)定,其RSD應(yīng)小于0.5%,這關(guān)系到定性定量的準(zhǔn)確性;

    ②流量范圍寬,分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)調(diào),制備型應(yīng)能達到100ml/min;

    ③輸出壓力高,一般應(yīng)能達到150~300KG/CM2:

    ④液缸容積?。?/p>

    ⑤密封性能好,耐腐蝕。

    泵的種類很多,按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔往復(fù)泵。恒壓泵受柱陰影響,流量不穩(wěn)定;螺旋泵缸體太大,這兩種泵己被淘汰目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。

    柱塞往復(fù)泵的液缸容積小,可至0.1ml,因此易于清洗和更換流動相,特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫;改變電機轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量,流量不受柱壓影響;泵壓可達400KG/CM2.ADW主要缺點是輸出的脈沖性較大,現(xiàn)多彩采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式,一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好(RSD為0.1%左右,串聯(lián)泵為0.2~0.3%),但出現(xiàn)故障的機會較多(因多了單向閥),價格也較貴。

    二、進樣器

    一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國RHEODYNE公司的7725和7725I型最常見),其關(guān)鍵部件由圓形密封墊子(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。耐高壓(35~40MPA),進樣量準(zhǔn)確,重復(fù)性好(0.5%),操作方便。六通閥進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時,進樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%(最多75%),并要求每次進樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注器取樣的熟練程度,而且易產(chǎn)生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時,進樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10倍9最少3倍,這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)和流動相,消除管壁效應(yīng),確保進樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。

    三、色譜柱

    色譜是一種分離分析手段,分離是核心,因此擔(dān)負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好,分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等,其粒度一般為3,5,7,10UM等,柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效;對于同系物分析,只要500即可;對于較難的分離物質(zhì)對則可采用高達2萬的柱子,因此一般10~30CM左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

    柱效受柱內(nèi)外因素影響,為使色譜柱達到最佳效率,除柱外死體積要小外,不要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù),在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的,靠近管壁的部位比較疏松,易產(chǎn)生溝流,流速較快,影響沖洗劑的流形,使譜帶加寬,這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中,柱外效應(yīng)對柱效的影響遠遠大于管壁效應(yīng)。

    四、檢測器

    HPLC的檢測器分為兩類:通用型檢測器和專用型檢測器。

    1.通用型檢測器可連續(xù)測量色譜柱的流出物的全部特性變化,通常采用差分測量法,這類檢測器包括示差折光檢測器、介電常數(shù)檢測器、電導(dǎo)檢測器等,通用檢測器適用范圍廣,但由于對流動相有響應(yīng),因此易受溫度變化、流動相和組分的變化的影響,噪聲和漂移都比較大,靈敏度較低,不能用梯度洗脫。

    2.專用型檢測器用以測量被分離樣品組分某種特性的變化。這類檢測器對樣品中組分的某種物理或化學(xué)性質(zhì)敏感,而這一性質(zhì)是流動相所不具備的,或至少在操作條件下不顯示。這類檢測器包括紫外檢測器、熒光檢測器、放射性檢測器等。

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