目的：比較黃藤素片微生物方法驗(yàn)證中的加菌方法不同，所出現(xiàn)的回收率差異。方法：采用離心法薄膜過(guò)濾法棄除黃藤素片中的抑菌成分。結(jié)果：離心前加入陽(yáng)性對(duì)照菌所得回收率非常低，采用薄膜過(guò)濾法的陽(yáng)性對(duì)照菌所得回收率可達(dá)70%以上，兩者有顯著性差異。結(jié)論：薄膜過(guò)濾法最后一次沖洗加入陽(yáng)性對(duì)照菌僅能說(shuō)明黃藤素片的抑菌作用可采用離心薄膜過(guò)濾法棄除，而不能反映該藥品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過(guò)程所污染的微生物。 2005版《中國(guó)藥典》在藥品微生物限度檢驗(yàn)方法項(xiàng)下增加了方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容，特別對(duì)有抑菌作用的藥品指出可采用離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法或聯(lián)合使用這些方法消除抑菌作用，并要求陽(yáng)性菌的加入方法是最后一次濾膜沖洗時(shí)。針對(duì)黃藤素片的抑菌情況，筆者采用離心薄膜過(guò)濾法消除其抑菌，并就其加入陽(yáng)性對(duì)照菌的方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)加入陽(yáng)性對(duì)照菌的方法不同，所得到的回收率差異是非常顯著的。

材料

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品黃藤素片分別由玉溪維和制藥有限公司（批號(hào)20040113，樣品1）、昆明制藥有限公司（批號(hào)20040452，樣品2）、云南滇池制藥有限公司（批號(hào)20040701，樣品3）提供。

1.1.2稀釋劑及培養(yǎng)基無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）按藥典配制，TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均來(lái)源于北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司。

1.1.3陽(yáng)性對(duì)照菌大腸桿菌［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

方法

1.2.1供試品的制備分別取樣10g，勻漿后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）至100mL，制成1∶10供試液備用。

1.2.2陽(yáng)性菌液制備取相應(yīng)菌株的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18～20h后用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）稀釋至相應(yīng)的濃度，備用。

1.2.3試驗(yàn)Ⅰ組分別吸取1∶10約含50～100個(gè)/mL陽(yáng)性菌的供試液10mL，置無(wú)菌離心管中，經(jīng)500r/min離心5min后，以無(wú)菌操作取上清液1mL置無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）100mL中，加入裝有直徑為50mm、孔徑為（0.45±0.02）μm的微孔濾膜的過(guò)濾器內(nèi)，減壓抽干后，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）沖洗濾膜3次，每次50～100mL，取出濾膜，按上述操作分別進(jìn)行5次，各置5皿，再注入約45℃的TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15mL，混勻，37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。

1.2.4試驗(yàn)Ⅱ組分別吸取1∶10供試液10mL置無(wú)菌離心管中，經(jīng)500r/min離心5min后，以無(wú)菌操作取上清液1mL置無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）100mL中，加入裝有直徑為50mm孔徑為(0.45±0.02)μm的微孔濾膜的過(guò)濾器內(nèi)，減壓抽干后，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）沖洗濾膜3次，每次50～100mL，最后一次沖洗時(shí)同時(shí)加入1mL約含50～100個(gè)/mL陽(yáng)性菌菌液，取出濾膜，按上述操作分別進(jìn)行5次，各置5皿，再注入約45℃的TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15mL，混勻，37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。

1.2.5供試品對(duì)照組分別吸取1∶10的供試液10mL，經(jīng)500r/min離心5min后，以無(wú)菌操作取上清液1mL置無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）100mL中，搖勻，以無(wú)菌操作加入裝有直徑為50mm孔徑為（0.45±0.02）μm的微孔濾膜的過(guò)濾器內(nèi)，減壓抽干后，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）沖洗濾膜3次，每次50～100mL，取出濾膜，按上述操作分別進(jìn)行5次，各置5皿，再注入約45℃的TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15mL，混勻，37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。

1.2.6陽(yáng)性對(duì)照組取制備好的約含50～100個(gè)/mL的陽(yáng)性菌菌液1mL，置于平皿中，分別置5皿，再注入約45℃的TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15mL，混勻，37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。

1.2.7陰性對(duì)照組取試驗(yàn)用的稀釋液10mL，照上述離心薄膜過(guò)濾法操作，作為陰性對(duì)照。

結(jié)果

2.1藥典常規(guī)方法結(jié)果采用2005年版《中國(guó)藥典》常規(guī)方法檢測(cè)三個(gè)批號(hào)黃藤素片陽(yáng)性菌回收率，在1∶10的稀釋級(jí)僅只有大腸桿菌加菌的回收率能達(dá)到70%以上，而在1∶10、1∶100的稀釋級(jí)加入其他三種標(biāo)準(zhǔn)菌，其回收率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于70%。說(shuō)明樣品有很強(qiáng)的抑菌作用，因此黃藤素片的微生物限度檢測(cè)不能采用常規(guī)方法檢測(cè)。

2.2不同加菌方法陽(yáng)性對(duì)照菌回收率由于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌在1∶10、1∶100的回收率無(wú)法達(dá)到藥典要求，且黃藤素片中含有一定的輔料，故改用離心薄膜過(guò)濾法測(cè)定。

討論

采用離心薄膜過(guò)濾法消除黃藤素片的抑菌作用，若在離心前加入陽(yáng)性對(duì)照菌，4種陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌的回收率非常低，這可能與離心沉降以及操作轉(zhuǎn)移過(guò)程中陽(yáng)性菌的損失和黃藤素片供試液對(duì)陽(yáng)性菌液存活率的影響有關(guān)。在薄膜過(guò)濾的最后一次沖洗時(shí)加入陽(yáng)性菌，上述4種陽(yáng)性菌的回收率均達(dá)到70%以上。兩種方法回收率的差距甚遠(yuǎn)。在薄膜過(guò)濾法最后一次沖洗時(shí)加入陽(yáng)性對(duì)照菌，盡管回收率已達(dá)到了中國(guó)藥典2005版微生物限度檢驗(yàn)驗(yàn)證方法的要求，但這僅只能說(shuō)明該藥品的抑菌作用可采用離心薄膜過(guò)濾法去除，而不能反映該藥品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過(guò)程中污染的微生物，因?yàn)樗廴镜奈⑸锟赡茉跅壋志奶幚磉^(guò)程中有損失。盡管采用離心薄膜過(guò)濾法棄除藥品中的抑菌作用是非常有效的處理辦法，但筆者認(rèn)為本法僅考慮到消除藥品的抑菌作用而忽略了采用該法可能導(dǎo)致藥品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過(guò)程污染的微生物在處理過(guò)程中損失的情況。鑒于微生物的特殊性，目前微生物檢驗(yàn)方法非常局限，如何能既消除藥品的抑菌作用同時(shí)又能保證在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過(guò)程污染的微生物不損失，還有待進(jìn)一步研究。