淋巴細(xì)胞分離是免疫檢驗(yàn)的重要考點(diǎn)，各位考生應(yīng)該熟練掌握，為此，醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)整理了與淋巴細(xì)胞分離的相關(guān)知識(shí)，希望對(duì)各位考生有所幫助。

原理：

外周血各種血細(xì)胞的密度不盡相同，利用淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

移液管、1ml移液器、刻度吸管、5ml注射器、EP管、顯微鏡、離心機(jī)。

實(shí)驗(yàn)材料：

肝素、淋巴細(xì)胞分離液、RPMI1640粉末、稀釋液（生理鹽水）。

操作流程：

1.在離心管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。

2.無(wú)菌采集靜脈血若干毫升,注入盛有肝素的無(wú)菌小瓶中，（每1ml全血加0.1ml125-250U/ml肝素溶液）,加蓋后立即輕輕搖勻,使血液抗凝。

3.稀釋?zhuān)ㄍ庵苎合♂屢?1：2取肝素抗凝血與等量生理鹽水充分混勻）。

4.用刻度吸管沿傾斜的管壁，把稀釋血緩慢疊加于分層液面上，醫(yī)學(xué)/教育網(wǎng)注意保持清楚的界面（Ficoll：稀釋血=1：2）。

5.放入離心機(jī)1500r/min離心20min（注：緩慢加速1-4檔個(gè)3分鐘）。

6.用吸管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一離心管中，加入5倍以上體積的稀釋液（生理鹽水），1500rpm×10分鐘離心，洗滌細(xì)胞。

7.重復(fù)洗滌一次，1500rpm×10分鐘離心。

8.末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞。

9.計(jì)數(shù)細(xì)胞后再調(diào)整細(xì)胞置所需濃度。

10.取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2%臺(tái)盼蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。

11.分離出的淋巴細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

1.每毫升外周血液大約可獲1×10⁶單個(gè)核細(xì)胞。

2.溫度直接影響到Ficoll的比重和分離效果。

3.在Ficoll上加入稀釋外周血時(shí)，應(yīng)緩慢加，以免沖散界面。

4.Ficoll應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋。

5.吸取單個(gè)核細(xì)胞層時(shí)，應(yīng)避免吸出過(guò)多的上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染。

淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)：

實(shí)驗(yàn)流程：

1.準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板。

2.制備細(xì)胞懸液：收集細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。

3.加樣：用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液。

4.計(jì)數(shù)：在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)。

5.計(jì)算：將結(jié)果代入下式，得出細(xì)胞密度。

胞數(shù)/毫升原=（4大格細(xì)胞數(shù)之和/4）×10⁴。

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