1.電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備

　　1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中。（同時(shí)做培養(yǎng)基和槍頭的空白對(duì)照）

　　2.37℃，220rpm，培養(yǎng)14-16個(gè)小時(shí)。

　　3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm，振搖2-3小時(shí)，每半小時(shí)測(cè)一次OD，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時(shí)，停止培養(yǎng)。

　　4.將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml 預(yù)冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10分鐘。

　　5.棄上清，離心杯中加入少量ddH2O，使沉淀懸浮后，再將水注滿(mǎn)離心杯，4℃，4000rpm離心10分鐘。

　　6.棄上清，加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿(mǎn)離心杯，4000rpm，4℃，離心10min.

　　7.棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油（滅菌，預(yù)冷），重懸菌體，再加滿(mǎn)10%甘油，  4℃， 4000rpm， 離心10min.

　　8.  棄上清，每個(gè)離心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液以300ul/管分裝于1.5ml的離心管中，-80 ℃冰箱中保存。同時(shí)取100 μl感受態(tài)加0.01ng puc18直接電穿孔轉(zhuǎn)化，檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率。

　　9.次日觀察轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況，并記錄。

　　2.連接產(chǎn)物純化

　　1.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列試劑：

　　10ul  of  ddH2O

　　2ul   of  3M NaAC（PH5.2）

　　50ul  of  無(wú)水乙醇

　　輕輕混勻，稍微離心并將其置于-20℃放置1小時(shí)以上；

　　2.4℃，top Speed 離心30分鐘；

　　3.小心移去上清，避免接觸到管底的沉淀物；

　　4.加入500ul70％的乙醇，輕輕顛倒幾次洗滌沉淀（注：不要離心混勻）；

　　5.4℃，top Speed離心5分鐘；

　　6.小心移去上清，將此Eppendorf管置空氣中直至無(wú)乙醇?xì)馕叮?/P>

　　7.加入10ulddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆茫?/P>

　　3.電轉(zhuǎn)化

　　1.從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；

　　2.取1 μl 純化后的質(zhì)粒于一1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷。

　　3.將40～100ul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml 的離心管中，小心混勻，冰上放置10min.

　　4.打開(kāi)電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1KV.

　　5.將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部；

　　6. 將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽(tīng)到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1000μl的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。

　　7.37℃，220－250rpm復(fù)蘇1小時(shí)。

　　8. 取20ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160ulSOC涂板，放于37℃溫室，過(guò)夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。其余菌液加1：1的30％的甘油后混勻－80℃保存。

　　注：每塊加有Amp的平板上均勻涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl.

　　4.電擊杯清洗流程

　　1.用清水將電擊杯稍沖一下。

　　2.向電擊杯中加入的75%酒精浸泡2hr.

　　3.棄去酒精，再用蒸餾水沖洗2~3遍，然后用1ml的槍吸取超純水反復(fù)吹打電擊杯10遍以上。

　　4.加入無(wú)水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30分鐘。

　　5.棄去無(wú)水乙醇，于通風(fēng)廚內(nèi)揮干乙醇。

　　6.將清洗好的電擊杯放入-20 ℃冰箱內(nèi)待用。

　　注：1.不同樣品使用的電機(jī)杯應(yīng)分開(kāi)；

　　2.每周用1％酒精浸泡30分鐘。