【關(guān)鍵詞】  缺血再灌注損傷； 血栓素A2； 前列環(huán)素； Na+K+ATP酶； Ca2+Mg2+ATP酶

　　肝臟缺血再灌注損傷是肝切除、嚴(yán)重肝外傷以及肝臟移植手術(shù)中經(jīng)常遇到的問(wèn)題和導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭的重要原因。研究表明缺血再灌注導(dǎo)致肝臟損傷的機(jī)制與細(xì)胞能量代謝障礙、線粒體功能受損、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基產(chǎn)生、一些細(xì)胞因子的合成與釋放等有關(guān)。參附注射液由人參、附子提取物組成，其有效成分為人參皂苷和烏頭類(lèi)生物堿。本文通過(guò)觀察參附注射液對(duì)血栓素A2（thromboxane A2， TXA2）和前列環(huán)素（prostacyclin， PGI2）、Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶的影響探討參附注射液保護(hù)肝缺血再灌注損傷的機(jī)制。

　　1  材料與方法

　　1.1  動(dòng)物分組與給藥  24只Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250 g，隨機(jī)分為肝缺血再灌注模型組和參附注射液（Shenfu Injection， SF）治療組。SF治療組給予參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)031115）10 ml/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)給藥6 d，第6天于手術(shù)前30 min給藥。模型組大鼠同樣方法給予相同劑量的生理鹽水。兩組均于第6天手術(shù)，給藥期間常規(guī)自由喂養(yǎng)，給水。

　　1.2  動(dòng)物模型及取材  術(shù)前12 h禁食，自由飲水。10％水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，剃除腹部體毛，局部消毒，取腹正中切口開(kāi)腹，開(kāi)腹后離斷肝周韌帶，包括鐮狀韌帶、肝胃韌帶、冠狀韌帶，消除肝臟側(cè)枝循環(huán)。用Pringle‘s法（無(wú)創(chuàng)傷微血管夾夾閉門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈、膽總管）使肝缺血，持續(xù)15 min后松開(kāi)血管夾，恢復(fù)肝臟血供，然后關(guān)腹。分別于再灌注1 h和3 h再次開(kāi)腹。先取一次性5 ml無(wú)菌注射器吸取消炎痛EDTANa2 0.2 ml，自下腔靜脈肝下段快速抽取靜脈血3 ml，即刻在空針內(nèi)顛倒混勻，3 500 r/min（上海手術(shù)器械廠802型離心沉淀器）、4 ℃離心15 min，分離血漿，－20 ℃保存。用取肝組織鑷子快速夾取大小約1 cm3和0.5 cm3兩塊肝組織，PBS液沖洗后分別置于10％福爾馬林溶液中固定和2.5％戊二醛溶液中固定，用于光學(xué)顯微鏡和電鏡檢查?？焖偾腥∈Ｓ喔谓M織，PBS液沖洗后立即置于液氮中冷凍，用錫箔紙包裹置于液氮中保存，再轉(zhuǎn)至－80 ℃冰箱中保存，待測(cè)Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶。然后處死大鼠。

　　1.3  檢測(cè)指標(biāo)與方法

　　1.3.1  血漿TXA2和PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物血漿血栓素B2（thromboxane B2， TXB2）和6酮前列腺素F1α（6ketoprostaglandin F1α， 6ketoPGF1α）測(cè)定  用放免法進(jìn)行測(cè)定，6ketoPGF1α和TXB2試劑盒購(gòu)自北京解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

　　1.3.2  肝組織ATP酶水平的測(cè)定  ATP酶測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，底物三磷酸腺苷鈉購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。用電子天平稱(chēng)取冰凍肝臟組織100 mg，先用比色法按考馬斯亮藍(lán)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定肝組織勻漿的蛋白含量，蛋白含量（g/L）=（測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（g/L）；同樣用比色法按測(cè)試盒說(shuō)明測(cè)定組織勻漿中ATP酶的活性，ATP酶活力（μmol Pi.mg prot1.h1）=［（測(cè)定管吸光度－對(duì)照管吸光度）/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度］×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（1 μmol/ml）×反應(yīng)體系中樣本稀釋倍數(shù)×6÷組織中蛋白含量（mg prot/ml）。

　　1.3.3  組織細(xì)胞學(xué)改變  分別采用光學(xué)顯微鏡和T. JEM1200EX透射電子顯微鏡觀察。

　　1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  肝組織ATP酶水平和血漿TXB2、6ketoPGF1α測(cè)定結(jié)果以x±s表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用成組t檢驗(yàn)。

　　2  結(jié)果

　　2.1  血漿TXB2、6ketoPGF1α濃度  肝臟缺血15 min，再灌注3 h后SF治療組血漿TXB2濃度較模型組低，而6ketoPGF1a濃度升高，TXB2/6ketoPGF1α比值明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)表1.

　　2.2  肝組織中ATP酶水平  肝缺血15 min，再灌注1 h和3 h，SF治療組肝組織中Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶水平均明顯高于模型組（P<0.05）。見(jiàn)表2.

　　2.3  組織細(xì)胞學(xué)改變  光鏡下模型組肝細(xì)胞濁腫、大片壞死，肝竇和微血管內(nèi)明顯淤血。SF治療組肝竇內(nèi)淤血和組織損傷明顯減輕，可見(jiàn)小灶狀壞死。電鏡下模型組肝細(xì)胞膜缺損、不連續(xù)，甚至溶解；細(xì)胞器中線粒體損傷尤為明顯，大量線粒體空泡變性、外膜溶解；核異染色質(zhì)邊集、凝集成塊，核膜不規(guī)則；SF治療組肝細(xì)胞損傷較輕，胞膜較完整，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，核內(nèi)充盈，但亦有染色質(zhì)邊集。見(jiàn)圖1～4.

　　表1  再灌注3 h血漿TXB2、6ketoPGF1α濃度及其比值（略）

　　Table 1  Plasma concentrations of TXB2 and 6ketoPGF1α and their ratio after threehour reperfusion

　　*P＜0.05， vs untreated group.

　　表2  再灌注1 h和3 h肝組織中ATP酶水平（略）

　　Table 2  Levels of hepatic tissue ATPases after one or threehour reperfusion

　　*P＜0.05， vs untreated group.

　　圖1  模型組肝細(xì)胞濁腫、竇內(nèi)淤血、大片壞死（HE染色，×100）（略）

　　Figure 1  Massive hepatocyte swelling， necrosis， sinusoidal and microvascular congestion in untreated group （HE staining， ×100）

　　圖2  SF治療組肝竇內(nèi)淤血和組織損傷明顯減輕，可見(jiàn)小片狀壞死（HE染色， ×100）（略）

　　Figure 2  Sinusoidal congestion and tissue injury were reduced significantly in SFtreated group （HE staining， ×100）

　　圖3  模型組肝細(xì)胞及其線粒體嚴(yán)重?fù)p傷（透射電鏡，×8 000）（略）

　　Figure 3  Severe injuries of hepatocytes and mitochondria in untreated group （transmission electron microscope， ×8 000）

　　圖4  SF治療組肝細(xì)胞和線粒體損傷減輕（透射電鏡，×8 000）（略）

　　Figure 4  Injuries of hepatocytes and mitochondria were reduced in SFtreated group （transmission electron microscope， ×8 000）

　　3  討論

　　肝臟缺血再灌注損傷首先表現(xiàn)的是微循環(huán)障礙，具有血管活性的細(xì)胞因子導(dǎo)致的微循環(huán)收縮是導(dǎo)致肝缺血再灌注損傷的一個(gè)重要因素。Kondo等［1］報(bào)告在肝臟缺血期，常溫下缺血20 min就導(dǎo)致肝血竇直徑和竇后小靜脈直徑在缺血末分別縮小25%和20%，而且缺血后的肝功能障礙與這種微循環(huán)的收縮有關(guān)。TXA2和PGI2是花生四烯酸代謝的兩個(gè)產(chǎn)物。PGI2具有很強(qiáng)的擴(kuò)血管作用，同時(shí)通過(guò)升高cAMP加強(qiáng)滲透屏障。內(nèi)源性PGI2的反應(yīng)性血管舒張作用維持比較短暫，更為重要的是PGI2可能激活依賴(lài)Ca2+激活的K+通道和依賴(lài)ATP激活的K+通道［2， 3］，這些離子通道的開(kāi)放可使細(xì)胞膜超極化，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載和起到持久舒張血管的作用［4~6］。而TXA2是一種很強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，能增加微血管的通透性。研究表明缺血再灌注后PGI2的釋放下降［7］或TXA2的釋放增加，在再灌注損傷中起著重要作用［8］。肝缺血再灌注時(shí)TXA2明顯升高，早期更趨明顯，晚期下降；PGI2的含量亦增高，但增高的梯度遠(yuǎn)低于TXA2；TXA2/PGI2比值在肝缺血再灌注早期增高明顯，再灌注24 h接近正常［9］。用TXA2合成酶抑制劑抑制TXA2的釋放或用受體拮抗劑阻斷TXA2效應(yīng)［10］，用PGI2擬似劑［8］或通過(guò)提高內(nèi)源性PGI2水平［7］，都可起到防護(hù)缺血再灌注損傷的作用。Xiao等［2］報(bào)告當(dāng)血栓素受體缺乏時(shí)也并不減輕心臟的缺血再灌注損傷，而當(dāng)PGI2受體缺乏時(shí)卻明顯加重心臟缺血再灌注損傷；內(nèi)源性PGI2水平下降比TXA2水平升高更易導(dǎo)致再灌注后的組織損傷。因此，改善PGI2與TXA2二者比例失衡是防護(hù)缺血再灌注損傷的一個(gè)重要機(jī)制。Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶是反映細(xì)胞能量代謝和建立跨膜的離子梯度、維持細(xì)胞膜電位與細(xì)胞內(nèi)外離子平衡的兩個(gè)重要的蛋白酶，在生理?xiàng)l件下又稱(chēng)依賴(lài)ATP的膜結(jié)合蛋白酶。肝臟缺血再灌注后二者的活性降低，熱缺血時(shí)降低更為嚴(yán)重，且與肝細(xì)胞死亡的方式相關(guān)［11］。谷天祥等［12］已證實(shí)二者泵功能抑制是心肌缺血再灌注后發(fā)生在亞細(xì)胞水平Ca2+超載的直接原因。肝缺血再灌注后Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶活性降低，導(dǎo)致亞細(xì)胞水平Na+、Ca2+、Mg2+重新分布，從而引起細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+超載和Mg2+降低。Na+K+ATP酶活性下降引起細(xì)胞內(nèi)Na+超載又激活細(xì)胞膜上Na+、Ca2+交換蛋白，使更多Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；同時(shí)還引起線粒體中Ca2+釋放，最終導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+超載。細(xì)胞內(nèi)Mg2+減少，一方面削弱它對(duì)Ca2+增多的生理拮抗作用，另一方面，低Mg2+本身還可降低細(xì)胞內(nèi)30多種酶的活力，抑制能量合成，增加細(xì)胞膜通透性和減少蛋白質(zhì)合成，結(jié)果細(xì)胞內(nèi)晶體滲透壓增高、水增加、細(xì)胞腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。提高二者的活性有助于減輕組織的缺血再灌注損傷［13］。本實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟在缺血15 min再灌注3 h后出現(xiàn)明顯的組織損傷，肝細(xì)胞腫脹、壞死；電鏡下大量線粒體水腫和空泡變性。在再灌注3 h參附注射液通過(guò)降低TXA2和提高PGI2改善PGI2與TXA2二者的比例失衡；在再灌注1 h、3 h參附注射液明顯提高Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶的活性；同時(shí)在再灌注3 h組織損傷明顯減輕。因此參附注射液通過(guò)改善缺血再灌注后PGI2與TXA2的比例失衡，和提高Na+K+ATP酶與Ca2+Mg2+ATP酶的活性保護(hù)大鼠肝臟缺血再灌注損傷。

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