【關(guān)鍵詞】  乙型肝炎病毒

　　Expression and purification of truncated C gene combined with preS1 gene from HBV in E.coli

　　HU XingBin， YIN Wen， WEI SanHua， LEI YingFeng， L Xin， SUN MengNing， YANG Jing， XU ZhiKai

　　Department  of  Microbiology， School of Basic Medicine， Fourth Military Medical University， Xian 710033， China

　　【Abstract】 AIM： To construct the prokaryotic recombinant plasmid to express HBV truncated C gene with preS1 gene and to acquire and purify the fused protein for antigenic analysis. METHODS：  The target gene was amplified by PCR and digested by restrictive enzyme before  cloned into pET28a. It was then transformed into E.coli DH5α and the positive recombinant plasmid named pET28aCtpreS1 was sequenced. The target protein was distinctly expressed after transformed into E.coli BL21 and induced with IPTG. The protein was scanned and purified on Ni2+NTA column and Western blot was performed after solubility analysis. RESULTS：  The recombinant plasmid pET28aCtpreS1 was successfully constructed and could efficiently express the target gene. Protein production mainly was in inclusion body but could be purified through Ni2+NTA column. The purified protein maintained the antigen activity. CONCLUSION：  The truncated HBcAg combined with preS1 antigen can efficiently be expressed and purified， which lays a foundation for further research of novel vaccine against HBV.

　　【Keywords】 hepatitis B virus； fused protein； prokaryotic expression； vaccine

　　【摘要】 目的： 構(gòu)建乙型肝炎病毒（HBV）截短C基因和前S1基因重組原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得融合蛋白的表達(dá)并進(jìn)行抗原性分析。 方法： PCR擴(kuò)增獲得截短C基因片段和前S1基因，雙酶切后克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，酶切鑒定得陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET28a并測(cè)序；然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，薄層掃描分析表達(dá)蛋白組成；可溶性分析后用Ni2+NTA凝膠親和層析柱純化、透析并濃縮融合蛋白，Western Blot分析特異性和抗原性。 結(jié)果： 成功構(gòu)建了HBV 截短C基因和前S1基因融合的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28aCtpreS1，目的基因可高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，Ni2+NTA 純化可獲得目的蛋白，純化蛋白具有良好的抗原性和特異性。 結(jié)論： HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表達(dá)并得到純化，為研究新型乙肝疫苗奠定了基礎(chǔ)。

　　【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；融合蛋白；原核表達(dá)；疫苗

　　0引言

　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）導(dǎo)致的病毒性肝炎目前尚無十分有效的治療措施，疫苗接種是控制和預(yù)防乙型肝炎的重要手段，但部分人群對(duì)現(xiàn)有的疫苗不應(yīng)答或低應(yīng)答而導(dǎo)致接種失敗，因此需要研發(fā)新型HBV疫苗。 我們利用基因重組技術(shù)構(gòu)建含截短C基因和preS1基因聯(lián)合的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白并進(jìn)行純化，初步分析其免疫性和特異性，為比較不同來源的HBV候選疫苗分子和深入研究HBV新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　E.coli  DH5α和BL21菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；pET28a質(zhì)粒由范雄林博士惠贈(zèng)； 帶HBV截短C基因和preS1基因的質(zhì)粒pDE22CtpreS1w由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建； Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶（TaKaRa公司）；膠回收試劑盒（上海華舜公司）；T4 DNA連接酶（上海生物工程公司）；Ni2+NTA凝膠親和層析柱（Qiagen公司）；HRP標(biāo)記羊人IgG，DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)和低分子蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（華美生物工程公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1PCR引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中的HBV C基因和前S1基因序列，利用生物學(xué)信息軟件設(shè)計(jì)其擴(kuò)增引物，以擴(kuò)增C基因編碼蛋白N端155個(gè)氨基酸的基因片段和前S1全基因。 上游引物P1：5′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′，含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物P2：5′GCGAAGCTTTTAACCCAGCCCGAATGCTCC3′，含HindⅢ酶切位點(diǎn)和終止碼TTA. 交上海生物工程公司合成。

　　1.2.2目的基因的擴(kuò)增以pDE22CtpreS1w質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒（1∶100稀釋）5 μL，10×Buffer 5 μL ，10 mmol/L dNTPs 4 μL，P1（100 pmol/L）2 μL，P2（100 pmol/L）2 μL，Taq DNA聚合酶 2 μL，用超純水補(bǔ)至終體積50 μL. 反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10 min. 取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。

　　1.2.3pET28aCtpreS1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定連接、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒鑒定均參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒交由北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。

　　1.2.4蛋白表達(dá)和可溶性分析自DH5α中提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落（同時(shí)設(shè)空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21為對(duì)照），置5 mL LB培養(yǎng)液中（含卡那霉素50 g／L），37℃振搖過夜，次日1∶100的稀釋度加入5 mL LB培養(yǎng)液中37℃振搖3 h后，測(cè)定A600 nm約0.4～0.6時(shí)加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37℃繼續(xù)振搖4～5 h，離心收菌。 用PBS（pH 8.0）懸浮離心收集的細(xì)菌，加入溶菌酶至終濃度0.1 g/L，4℃放置20 min，超聲破碎，4℃下10 000 g離心10 min，收集上清和沉淀。 將菌體沉淀、裂解上清、裂解沉淀和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌分別加入等體積的2×樣品緩沖液，沸水中加熱5 min，12 000 g離心5 min，取上清，每孔15 μL進(jìn)行SDSPAGE電泳，電泳在恒壓下進(jìn)行（濃縮膠中為100 V，分離膠中為120 V）。 電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色2 h，然后用脫色液脫色至背景清晰。 薄層掃描分析目的蛋白表達(dá)帶占菌體蛋白百分比。

　　1.2.5親和層析法純化表達(dá)蛋白參照Qiagen公司鎳離子親和層析柱（Ni2+NTA）操作說明進(jìn)行。 首先離心收集1 L誘導(dǎo)宿主菌，冰浴15 min；按5 L/kg濕菌的比例加入含8 mol/L尿素 的Buffer B（pH 8.0），室溫下輕輕攪拌使細(xì)菌裂解至溶液清亮，4℃下10 000 g離心收集上清，棄去沉淀；將1 mL Ni2+NTA樹脂懸浮液與一定量清亮裂解上清于室溫輕柔搖動(dòng)混勻（100 r/min搖動(dòng)15～60 min） 后，將其混合液裝柱；依次用 Buffer C（pH 6.3）， Buffer D（pH 5.9）， Buffer E（pH 4.5）洗脫，分別收集洗脫液。 取各部分樣品進(jìn)行SDSPAGE分析。

　　1.2.6Western Blot檢測(cè)表達(dá)蛋白將純化蛋白進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，然后將蛋白質(zhì)進(jìn)行電轉(zhuǎn)移至NC膜上（濾膜孔徑0.22 μm，轉(zhuǎn)移條件為恒流100 V，1 h）。 用乙型肝炎陽(yáng)性患者抗HbcAg，抗preS1陽(yáng)性血清（來自西京醫(yī)院檢驗(yàn)科）作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗人的IgG作為二抗，DAB（0.6 g／L）顯色，至目的條帶染色清晰時(shí)終止反應(yīng)。

　　2結(jié)果

　　2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物預(yù)期大?。s630 bp）處出現(xiàn)條帶（圖1）。 序列測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

　　2.2融合蛋白的表達(dá)與溶解形式分析經(jīng)SDSPAGE電泳檢測(cè)，在Mr約24 000處有一明顯的條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小一致。 該融合蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，上清液中幾乎無誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白。 薄層掃描顯示其占菌體蛋白的40%（圖2）。

　　2.3融合蛋白的大量表達(dá)及純化目的蛋白在Buffer D（pH 5.9），Buffer E（pH 4.5）洗脫液中，掃描顯示純度在90%以上（圖3）。

　　2.4表達(dá)蛋白的Western blot預(yù)期大小處可見條帶染色清晰，純化的蛋白很好地保持了與HBV陽(yáng)性患者血清的結(jié)合活性（圖4）。

　　3討論

　　疫苗是預(yù)防HBV感染的重要手段，但相當(dāng)數(shù)量的接種者對(duì)現(xiàn)臨床使用的疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答，而為數(shù)眾多的感染者需要有效的治療，所以迫切需要新型HBV疫苗。

　　抗原特異性CTL所介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用在病毒感染的控制和痊愈過程中起核心作用［2-3］。 多個(gè)CTL表位的疫苗研究策略是近年各類HBV新型疫苗研究的熱點(diǎn)。 HBV核心C基因在不同亞型間最為保守， 在它編碼的180多個(gè)氨基酸中，CTL表位多位于第150位氨基酸（amino acid， AA）以前，其中18～27位AA為HLAA0201所限制，第88～96位AA被HLAA11所限制，第141～150位AA為HLAAw68和HLAA31分子所限制，此外第75～81位AA或72～88位AA是很強(qiáng)的構(gòu)像型B細(xì)胞表位，因此核心抗原是比較理想的疫苗研究靶分子［4-5］。 在既往HBV疫苗研究中人們大多選用S基因編碼的蛋白，并輔以CpG， IL2等分子佐劑試圖達(dá)到免疫目的，但效果并不理想［6-7］。 而preS1基因編碼蛋白含有HBV和肝細(xì)胞膜結(jié)合的位點(diǎn)，并且相當(dāng)保守， 肝細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞均可表達(dá)針對(duì)其第21～47位AA的受體，故前S1抗體是除表面抗體外又一重要的中和抗體［8］。 因此HBV的C基因和preS1基因已經(jīng)成為近年來HBV新型疫苗研究的重點(diǎn)［9］。

　　幾乎所有新型HBV疫苗如亞單位疫苗、DNA疫苗、分枝肽合成疫苗、新載體疫苗或植物轉(zhuǎn)基因疫苗的前期研究工作中都需要候選分子高效表達(dá)，以便在體外評(píng)價(jià)疫苗候選分子刺激細(xì)胞增殖的潛力和CTL殺傷效應(yīng)，達(dá)到全面評(píng)價(jià)候選分子的目的［10-12］。 而HBV各個(gè)基因片段原核表達(dá)難易程度不同，考慮到C基因原核表達(dá)難度低，本研究采用將截短C基因置于preS1基因前面的方式，構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒并獲得了高效表達(dá)。 目的蛋白純化以后，Western blot進(jìn)一步證實(shí)該濃縮蛋白可以與抗HBcAg、抗preS1陽(yáng)性患者血清結(jié)合，具有很好的抗原性和特異性，可用于進(jìn)一步的HBV新型疫苗研究；與Chen等［9］采用經(jīng)典的preS1基因在前、C基因在后的表達(dá)方式所獲取的同類蛋白相比，本研究中蛋白表達(dá)量明顯較高。 在后續(xù)工作中，我們將選用新型的疫苗載體BCG運(yùn)載候選疫苗分子，進(jìn)一步研究該蛋白在CTL免疫和體液免疫中的作用。

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