【摘要】  研究慢性束縛應(yīng)激大鼠（肝郁脾虛模型）的血漿代謝表型改變，開(kāi)展中醫(yī)證候?qū)W的研究，試圖通過(guò)對(duì)慢性束縛應(yīng)激大鼠代謝物組的共性分析和生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，尋找肝郁脾虛證候的生物學(xué)本質(zhì)，探討代謝組學(xué)在中醫(yī)證候?qū)W研究中的應(yīng)用。方法：選用實(shí)驗(yàn)用二級(jí)雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為4組：7 d正常對(duì)照組（A組）、21 d正常對(duì)照組（B組）、 7 d 模型組（C組）和21 d模型組（D組），每組6只。以慢性束縛方法制作應(yīng)激大鼠模型。分別于第8天和第22天麻醉后心室取血，用Varian UnityInova 600 M超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）波譜儀檢測(cè)。自由感應(yīng)衰減信號(hào)經(jīng)過(guò)32 k傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR譜圖。調(diào)用VNMR軟件中的程序?qū)?H譜按默認(rèn)值，分別從4.5～0.5 ppm（弛豫時(shí)間編輯）以及6.0～0 ppm（擴(kuò)散編輯），每段為 0.04 ppm ，進(jìn)行分段積分，將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化后，以文本文件或Excel文件貯存，用于模式識(shí)別分析。將上述得到的數(shù)據(jù)文件利用Simca-P 10.0軟件包進(jìn)行主成分分析。結(jié)果：大鼠血漿 1H NMR譜的主成分分析，各組動(dòng)物代謝譜各不相同，與已知應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物體內(nèi)代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程及結(jié)果相一致。正常對(duì)照組與模型組相比較發(fā)現(xiàn)，醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和3.44 ppm的未知化合物的譜峰峰形改變較為明顯。這些發(fā)生改變的代謝物可以作為肝郁脾虛證的生物標(biāo)志物做進(jìn)一步的研究。結(jié)論：各組大鼠血漿 1H NMR代謝譜之間存在差異，而且可能從代謝組學(xué)分析中找出特異的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物，闡釋中醫(yī)證候的生物學(xué)本質(zhì)。代謝組學(xué)分析是一種有良好發(fā)展前景的中醫(yī)證候?qū)W研究方法。

　　【關(guān)鍵詞】  代謝組學(xué)

　　代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來(lái)的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。它主要研究生物對(duì)外源性物質(zhì)所引起的病理生理反應(yīng)，以及對(duì)遺傳變異的應(yīng)答和內(nèi)源性代謝物的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)對(duì)生物體液和組織中隨時(shí)間改變的代謝物進(jìn)行檢測(cè)、確定、定量和分類，將這些代謝信息與病理生理過(guò)程中的生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來(lái)，以監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的化學(xué)變化。本課題組用慢性束縛應(yīng)激大鼠模型，以動(dòng)物行為學(xué)評(píng)定和以方測(cè)證等方法確定該模型為肝郁脾虛證候模型，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)開(kāi)展中醫(yī)證候?qū)W的研究，試圖通過(guò)對(duì)中醫(yī)病證引起的代謝物的共性分析和生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，尋找中醫(yī)證候的生物學(xué)本質(zhì)，促進(jìn)中醫(yī)辨證的科學(xué)化和定量化，將代謝組學(xué)技術(shù)和中醫(yī)藥學(xué)的研究結(jié)合起來(lái)，探索出中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系研究的新方法與新途徑。

　　1 材料與方法

　　1.1 動(dòng)物與分組 實(shí)驗(yàn)用二級(jí)雄性SD大鼠 24只 ，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)為SCXK-京2002-0003.適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為：7 d正常對(duì)照組（A組）、21 d正常對(duì)照組（B組）、7 d模型組（C組）和21 d模型組（D組）4組，每組各6只。動(dòng)物每籠6只群養(yǎng)，飼養(yǎng)于普通級(jí)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度保持為（22±2）℃，相對(duì)濕度保持為30%～40%，各組大鼠喂常規(guī)飼料，自由進(jìn)食飲水。

　　1.2 造模方法 以慢性束縛方法制作大鼠肝郁脾虛證模型，將大鼠束縛于特制的束縛架上（T型束縛臺(tái)：底座寬10 cm、長(zhǎng)20 cm、厚2.8 cm，上端束縛臺(tái)長(zhǎng)22 cm，最寬處6.6 cm，前端有固定頭部的小架和適合四肢放置的凹槽，上端束縛臺(tái)有3條可調(diào)的軟 帶，兩寬一窄，分別在頭頸部、胸腰和腰背固定）， 3 h/d ，C組連續(xù)7 d，D組連續(xù)21 d，隨機(jī)選取束縛時(shí)間點(diǎn)。整個(gè)束縛過(guò)程中動(dòng)物在同一環(huán)境中，不予以進(jìn)水和食物。正常對(duì)照組均散養(yǎng)于各自的飼養(yǎng)箱中3 h.

　　1.3 取材與處理［1，2］ 分別于第8天和第22天清晨8時(shí)，用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射進(jìn)行深度麻醉，手術(shù)剪剖開(kāi)胸腔，用注射器穿刺左心室取血漿，采集血漿后于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）測(cè)量前樣品準(zhǔn)備：取出血漿，常溫解凍，用德國(guó)Ep-pendorf公司產(chǎn)5424型離心機(jī)離心（14 000 r/min， 10 min），取上清300 μl，添加0.1% 2，2，3，3，三甲基甲硅烷基丙酸｛3-（trimethylsiyl）［2，2，3，3-2H4］propionate， TSP｝重水溶液100 μl、200 μl D2O于 5 mm 樣品管中，混勻，于4 ℃冰箱保存，備用。

　　1.4 NMR數(shù)據(jù)采集 在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心核磁共振實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，27 ℃條件下，在Varian UnityInova 600 M 超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振波譜儀上調(diào)用弛豫時(shí)間編輯（Carr-Purcell-Meiboom-Gill， CPMG）和擴(kuò)散編輯（longitudinal eddy-delay， LED）相關(guān)脈沖序列，采用預(yù)飽和方式抑制水峰，飽和時(shí)間為2 s，混合時(shí)間為0.15 s，譜寬8 000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)32 k，累加次數(shù)64次，預(yù)飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。自由感應(yīng)衰減（free induction decay， FID）信號(hào)經(jīng)過(guò)32 k傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR譜圖。以TSP為化學(xué)位移參考峰的位置，設(shè)為0 ppm.調(diào)用VNMR軟件中的程序?qū)?H 譜按默認(rèn)值，分別從4.5～0.5 ppm（CPMG）以及6.0～0 ppm（LED），每段為0.04 ppm，進(jìn)行分段積分。將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化之后，以文本文件或Excel文件貯存，用于模式識(shí)別分析。

　　1.5 主成分分析 將積分值進(jìn)行中心化和比例換算，用SIMCA-P 10.0軟件包（瑞典， Umetrics AB， Umea）進(jìn)行主成分分析（principal component analysis ， PCA），求出主成分（principal compo-nents， PC），利用PC對(duì)各組大鼠血清的代謝組分進(jìn)行分析，必要時(shí)進(jìn)行判別分析（partial least squares discriminate analysis， PLS-DS）。

　　2 結(jié)果

　　2.1 四組動(dòng)物血清1H NMR圖譜 見(jiàn)圖1.

　　圖1 四組動(dòng)物血清的典型1H NMR譜圖（略）

　　Figure 1 Serum spectra of 600-M Hz1H NMR in 4 groups

　　A： Group A （7 d normal control group）； B： Group B （21 d normal control group）； C： Group C （7 d stress group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　2.2 時(shí)點(diǎn)相同的正常對(duì)照組與模型組動(dòng)物血清1H NMR譜模式識(shí)別分析 A、C兩組動(dòng)物血清LED實(shí)驗(yàn)1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見(jiàn)圖2.LED實(shí)驗(yàn)表明：A、C兩組大致以t5軸分開(kāi)，A組樣本中極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein， VLDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein， LDL）（0.87、0.91、0.95和0.99）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein， HDL）（0.83）、膽堿（ 3.23 和3.27）、N-乙酰糖蛋白（N-acetyl-glycopro-tein， NAC）NAC1（2.07）等化合物含量較高； C組長(zhǎng)鏈脂肪酸（1.31、1.23、1.27、1.36和1.39）、NAC2（ 2.15 ）以及1.59 ppm處未知化合物含量較高。

　　B、D兩組動(dòng)物血清LED實(shí)驗(yàn)1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見(jiàn)圖3.B、D兩組樣本間沿t4軸方向基本分開(kāi)。從因子載荷圖上看，B組樣本中LDL（0.87、0.91和1.27）以及化學(xué)位移在4～5左右的含氧脂肪酸、不飽和脂肪酸等化合物的含量較高；D組樣本中LDL含量不高，NAC1（2.07）、 NAC2（2.16）及化學(xué)位移在1～3之間的飽和脂肪酸含量較高。A、C兩組動(dòng)物血清CPMG實(shí)驗(yàn)1H NMR譜的波峰積分值的PLS-DA結(jié)果見(jiàn)圖4.CPMG實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A組和C組組內(nèi)樣本間個(gè)體差異較大，且點(diǎn)c5與其他點(diǎn)有明顯差異。在排除點(diǎn)c5的基礎(chǔ)上進(jìn)行PLS-DS.從得分圖中可以看出，A、C兩組可被圖中所示虛線大致分開(kāi)。從因子載荷圖中可以看出，A組樣本中乳酸（1.36、1.38、1.4、4.16和 4.12 ）、丙氨酸（1.44）、脂類化合物（0.92和1.36）、血糖（3～4）、NAC2（2.16）以及谷氨酸（2.4）含量較高；而C組樣本中NAC1（2.08）、小分子化合物（ 1.12 ）以及乙醇和1.2 ppm與3.4 ppm所代表的未知化合物含量較高。B和D組進(jìn)行的CPMG實(shí)驗(yàn)，PLS-DS和PCA兩組都未能分開(kāi)。

　　2.3 不同時(shí)點(diǎn)的正常對(duì)照組組間和模型組組間的動(dòng)物血清1H NMR譜模式識(shí)別分析 A、B兩組動(dòng)物血清LED實(shí)驗(yàn)1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見(jiàn)圖5.LED實(shí)驗(yàn)表明：A、B兩組被圖中所示虛線較好地分開(kāi)。因子載荷圖結(jié)合原始圖譜分析，A組樣本中VLDL和LDL（0.87、0.91、1.27、1.31和1.35）、膽堿（3.23、3.27）以及不飽和脂肪酸（ 1.99 、5.31和5.35）等化合物含量較高；B組僅化學(xué)位移在3～4之間的可能為含氧脂肪酸的化合物含量較高。C、D兩組動(dòng)物血清LED實(shí)驗(yàn)1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見(jiàn)圖6.C、D兩組分組趨勢(shì)明顯，但是點(diǎn)c6與本組其他樣本間有明顯不同。排除c6后仍進(jìn)行PCA分析，得分圖中可看出，C、D兩組沿t1軸能較好地分開(kāi)，因而t1軸方向表示組間差異；各組內(nèi)樣本沿t2軸方向散開(kāi)，因而t2軸方向表示組內(nèi)差異。因子載荷圖結(jié)合原始譜圖分析，C組樣本中VLDL和LDL（0.87、0.91、1.27、1.31和1.35）、膽堿（3.23、3.27）以及不飽和脂肪酸（5.31、5.35）等化合物含量較高；而D組中僅化學(xué)位移在 3～4 之間的可能為含氧脂肪酸的化合物和NAC含量較高。A、B兩組動(dòng)物血清CPMG實(shí)驗(yàn)1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見(jiàn)圖7.CPMG實(shí)驗(yàn)表明，A、B兩組樣本可被如圖所示虛線大致分開(kāi)。從因子載荷圖中可以看出，A組樣本中乳酸（1.36）、蘇氨酸（1.32）、脂類化合物（0.92、0.96）、丙氨酸（1.52）、NAC1（2.08）、3-羥基丁酯（1.28）以及2～3之間的小分子化合物含量較高；而B(niǎo)組樣本中血糖（3～4）、谷氨酸（2.44）、醋酸（1.96）及1.48 ppm和 1.24 ppm 處所表示的未知化合物含量較高。

　　C、D兩組動(dòng)物血清CPMG實(shí)驗(yàn)1H NMR譜的波峰積分值的PCA結(jié)果見(jiàn)圖8.C、D兩組樣本沿t2軸顯示出一定的分組趨勢(shì)，但兩組內(nèi)樣本間差異太大，而且c5和d1兩樣本與其他樣本間有明顯不同。排除c5和d1后對(duì)剩余數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，從得分圖中可看出，兩組樣本被圖中所示虛線分開(kāi)。從因子載荷圖中可看出，C組樣本中脂類化合物（ 0.96 、0.89、0.92、1.32和1.36）、血糖（3～4）、NAC1（2.08）、NAC2（2.2），以及1.24 ppm和 3.4 ppm 處所表示的化合物含量較高；D組樣本中乳酸（1.4、 4.16 ）、醋酸（1.96）、膽堿（3.24）、 1.48 ppm 等處化合物含量較高。

　　2.4 對(duì)1H NMR圖譜及模式識(shí)別的進(jìn)一步分析 各正常對(duì)照組圖中主成分積分值基本集中分布于橢圓形散點(diǎn)圖（95%置信區(qū)內(nèi)）的4個(gè)區(qū)域，各正常對(duì)照組間無(wú)明顯交叉和重疊。對(duì)其進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，C、D兩組中醋酸（1.99、4.12、4.16）及3.44 ppm的未知化合物的譜峰相對(duì)積分面積明顯增高而乳酸（1.34）、酪氨酸（6.95、7.27）和LDL（0.87、0.9、0.95和0.99）的譜峰相對(duì)積分面積明顯下降。見(jiàn)圖1、2、3和4.

　　圖2 A、C兩組血清代謝組PCA分值（t［4］ vs t［5］）散點(diǎn)分布和因子載荷（p［4］ vs p［5］）圖（擴(kuò)散編輯）（略）

　　Figure 2 PCA score （t［4］ vs t［5］） and loading （p［4］ vs p［5］） plots for groups A and C serum spectra （LED）

　　A： Group A （7 d normal control group）； C： Group C （7 d stress group）。

　　圖3 B、D兩組血清代謝組PCA分值（t［3］ vs t［4］）散點(diǎn)分布和因子載荷（p［3］ vs p［4］）圖（擴(kuò)散編輯）（略）

　　Figure 3 PCA score （t［3］ vs t［4］） and loading （p［3］ vs p［4］） plots for groups B and D serum spectra （LED）

　　B： Group B （21 d normal control group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　圖4 A、C兩組血清代謝組PLS-DS分值（t［1］ vs t［2］）散點(diǎn)分布和因子載荷（w*c［1］ vs w*c［2］）圖（弛豫編輯）（略）

　　Figure 4 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （w*c［1］ vs w*c［2］） plots for groups A and C serum spectra （CPMG）

　　A： Group A （7 d normal control group）； C： Group C （7 d stress group）。

　　圖5 A、B兩組血清代謝組PCA分值（t［1］ vs t［2］）散點(diǎn)分布和因子載荷（p［1］ vs p［2］）圖（擴(kuò)散編輯）（略）

　　Figure 5 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （p［1］ vs p［2］） plots for groups A and B serum spectra （LED）

　　A： Group A （7 d normal control group）； B： Group B （21 d normal control group）。

　　圖6 C、D兩組血清代謝組PCA分值（t［1］ vs t［2］）散點(diǎn)分布和因子載荷（p［1］ vs p［2］）圖（擴(kuò)散編輯）（略）

　　Figure 6 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （p［1］ vs p［2］） plots for groups C and D serum spectra （LED）

　　C： Group C （7 d stress group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　圖7 A、B兩組血清代謝組PCA分值（t［2］ vs t［3］）散點(diǎn)分布和因子載荷（p［2］ vs p［3］）圖（弛豫編輯）（略）

　　Figure 7 PCA score （t［2］ vs t［3］） and loading （p［2］ vs p［3］） plots for groups A and B serum spectra （CPMG）

　　A： Group A （7 d normal control group）； B： Group B （21 d normal control group）。

　　圖8 C、D兩組血清代謝組PCA分值（t［1］ vs t［2］）散點(diǎn)分布和因子載荷（p［1］ vs p［2］）圖（弛豫編輯）（略）

　　Figure 8 PCA score （t［1］ vs t［2］） and loading （p［1］ vs p［2］） plots for groups C and D serum spectra （CPMG）

　　C： Group C （7 d stress group）； D： Group D （21 d stress group）。

　　3 討論

　　本課題組在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激狀態(tài)下，中樞內(nèi)源性阿片肽及相關(guān)指標(biāo)在海馬、皮層和邊緣系統(tǒng)出現(xiàn)異常變化，中藥三個(gè)復(fù)方（疏肝、健脾和補(bǔ)腎）對(duì)其變化均有不同程度的調(diào)整作用，而疏肝中藥對(duì)皮層和海馬的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于其他兩種復(fù)方，并顯示出多靶點(diǎn)和雙向調(diào)節(jié)作用。作用途徑其一是對(duì)模型大鼠行為學(xué)異常變化有恢復(fù)作用，其二是增強(qiáng)模型大鼠免疫功能，其三是增加模型大鼠下丘腦單胺遞質(zhì)等含量，增加模型大鼠海馬單胺遞質(zhì)含量與海馬腦啡肽與前強(qiáng)啡肽mRNA表達(dá)，增加模型大鼠中樞糖皮質(zhì)激素受體及相關(guān)mRNA表達(dá)，增加模型大鼠中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量。研究發(fā)現(xiàn)，逍遙散對(duì)慢性應(yīng)激狀態(tài)下中樞內(nèi)源性阿片肽有調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)位點(diǎn)位于下丘腦、邊緣系統(tǒng)和皮層，提出肝主疏泄在應(yīng)激調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用，從肝論治應(yīng)激導(dǎo)致的氣血紊亂與補(bǔ)脾和補(bǔ)腎同等重要，肝主疏泄與應(yīng)激的調(diào)節(jié)位點(diǎn)除下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)以外，還有海馬和皮層等邊緣系統(tǒng)；提出神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和內(nèi)源性阿片肽通過(guò)對(duì)海馬的保護(hù)作用來(lái)影響下丘腦-垂體-靶腺軸，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)，驗(yàn)證慢性束縛應(yīng)激大鼠為肝郁脾虛證模型。在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)地提出了肝主疏泄的現(xiàn)代生理學(xué)內(nèi)涵以及肝郁脾虛證的病理生理基礎(chǔ)［3～8］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，從1H NMR圖譜及模式識(shí)別分析發(fā)現(xiàn)：（1）各正常對(duì)照組圖中主成分積分值基本集中分布于橢圓形散點(diǎn)圖（95%置信區(qū)內(nèi)）的4個(gè)區(qū)域，各正常對(duì)照組間無(wú)明顯交叉和重疊。表明正常組與模型組之間存在代謝產(chǎn)物譜的顯著差異。也就是說(shuō)正常組與以慢性束縛方法制作的應(yīng)激大鼠肝郁脾虛證模型組之間有著代謝產(chǎn)物的不同，說(shuō)明血漿代謝組學(xué)分析能夠較好地反映證候之間的差異，代謝組學(xué)技術(shù)是開(kāi)展中醫(yī)證候研究的好方法。（2）在1H NMR圖譜中可以發(fā)現(xiàn)醋酸、乳酸、酪氨酸、LDL和3.44 ppm的未知化合物的譜峰峰形改變較為明顯。這些發(fā)生改變的代謝物可以作為肝郁脾虛證的生物標(biāo)志物做進(jìn)一步的研究。（3）醋酸、乳酸、LDL、酪氨酸與三羧酸循環(huán)能量代謝、糖酵解及脂肪和蛋白質(zhì)代謝途徑密切相關(guān)，上述內(nèi)源性代謝物的改變提示動(dòng)物能量代謝及脂肪、蛋白質(zhì)代謝功 能異常，這與已知的應(yīng)激狀態(tài)動(dòng)物體內(nèi)代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程及結(jié)果相一致。分析這些內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)移機(jī)制和過(guò)程，可提示肝郁脾虛證的發(fā)生發(fā)展的潛在原因，從而揭示其生物學(xué)本質(zhì)。中醫(yī)證候之間可能存在著非常明顯的代謝產(chǎn)物的不同，這種不同是基于不同證候存在著不同物質(zhì)代謝或其代謝網(wǎng)路的改變。中醫(yī)證候的生物學(xué)基礎(chǔ)可能用代謝組學(xué)技術(shù)來(lái)找出特異的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物，用生物信息學(xué)方法分析生物標(biāo)志物的功能，并確定“中醫(yī)證候相關(guān)代謝譜”。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　1Waters NJ， Waterfield CJ， Farrant RD， et al. Metabo-nomic deconvolution of embedded toxicity： application to thioacetamide hepato- and nephrotoxicity. Chem Res Toxicol. 2005； 18（4）： 639-654.

　　2 Lindon JC， Nicholson JK， Holmes E， et al. Metabo-nomics： metabolic processes studied by NMR spectros-copy of biofluids. Concepts Magn Reson. 2000； 12（5）： 289-320.

　　3 Chen JX， Li W， Zhao X， et al. Effects of Chinese herbs on enkaphalin mRNA and prodynorphin mRNA gene expression in rat hippocampus with chronic immobiliza-tion stress. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2005； 21（2）： 121-125. Chinese with abstract in Eng-lish.陳家旭， 李偉， 趙歆， 等。 慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬腦啡肽mRNA和前強(qiáng)啡肽mRNA表達(dá)及中藥復(fù)方的影響。 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志。 2005； 21（2）： 121-125.

　　4 Xu HY， Zhao X， Chen JX， et al. Changes of L-ENK in area CA1 of rats‘ hippocampus in condition of chronic immobilization stress and regulating actions of Xiaoyao powders. Shi Jie Ke Xue Ji Shu-Zhong Yi Yao Xian Dai Hua. 2005； 7（5）： 18-22. Chinese.徐洪雁， 趙歆， 陳家旭， 等。 慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬CA1區(qū)L-ENK的變化及逍遙散的調(diào)節(jié)作用。 世界科學(xué)技術(shù)—— —中醫(yī)藥現(xiàn)代化 2005； 7（5）： 18-22.

　　5 Chen JX， Yang JX， Zhao X， et al. Changes of β-endor-phine in rats‘ hypothalamus in condition of chronic immobilization stress and influence of Chinese herbal prescriptions. Zhongguo Yi Yao Xue Bao. 2004； 19（2）： 83-85. Chinese.陳家旭， 楊建新， 趙歆， 等。 慢性束縛應(yīng)激大鼠下丘腦-β內(nèi)啡肽變化及中藥復(fù)方對(duì)其的影響。 中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)。 2004； 19（2）： 83-85.

　　6 Chen JX， Tang YT. Effect of Xiaoyao powder on changes of relative brain zone CRF gene expression in chronic restrained stress rats. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2004； 20（1）： 71-74. Chinese with abstract in English.陳家旭， 唐已婷。 逍遙散對(duì)慢性束縛應(yīng)激模型大鼠相關(guān)腦區(qū)CRF基因表達(dá)的影響。 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志。 2004； 20（1）： 71-74.

　　7 Chen JX， Li W， Zhao X， et al. Effects of three TCM formulas on the behavior and NT_3 in the cortex andhippocampus in the rats irritated by the chronic stressor of restraint. Beijing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 2004； 27（2）： 19-23. Chinese with abstract in English.陳家旭， 李偉， 趙歆， 等。 三種中藥復(fù)方對(duì)慢性束縛應(yīng)激大鼠行為及皮層和海馬NT3的影響。 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)。 2004； 27（2）： 19-23.

　　8 Chen JX， Li W， Zhao X， et al. Changes of mRNA expression of enkephalin and prodynorphin in hippocam-pus of rats with chronic immobilization stress. World J Gastroenterol. 2004； 10（17）： 2 547-2 549.