【摘要】  通過觀察實(shí)驗(yàn)豚鼠膽囊細(xì)胞鈣離子濃度（［Ca 2+］i）的變化，探討膽固醇結(jié)石形成與養(yǎng)肝柔肝中藥防治膽結(jié)石的作用機(jī)制。方法：將80只受試豚鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、養(yǎng)肝柔肝中藥組和熊去氧膽酸組，每組20只。后三組采用高膽固醇致石食餌誘發(fā)法建立豚鼠膽結(jié)石動物模型，其中養(yǎng)肝柔肝中藥組、熊去氧膽酸組分別給予相應(yīng)藥物進(jìn)行防治實(shí)驗(yàn)，連續(xù)用藥7周后，分別對實(shí)驗(yàn)豚鼠大體情況、膽結(jié)石生成情況以及膽囊細(xì)胞［Ca2+］i的變化進(jìn)行觀察。結(jié)果：模型組動物膽囊細(xì)胞［Ca 2+］i明顯降低，養(yǎng)肝柔肝中藥不僅能明顯改善豚鼠行為學(xué)體征，降低膽結(jié)石的成石率，而且可提高膽囊細(xì)胞［Ca2+］i.結(jié)論：膽囊細(xì)胞［Ca2+］i降低是導(dǎo)致膽囊的收縮功能降低，膽固醇結(jié)石形成的重要因素。提高膽囊細(xì)胞［Ca2+］i，增強(qiáng)膽囊平滑肌細(xì)胞的收縮功能，減輕膽汁淤滯，可能是養(yǎng)肝柔肝中藥防治膽石病的作用機(jī)制之一。

　　【關(guān)鍵詞】  膽固醇

　　我國膽石病呈較快的上升趨勢，部分地區(qū)患病率已達(dá)10%［1］，接近世界發(fā)達(dá)國家膽石病10%～15%的發(fā)病水平［2］。膽石病仍是我國良性膽道疾患中致死、致殘的重要原因。我們的前期研究工作表明，養(yǎng)肝柔肝中藥對膽石病具有一定的臨床療效［3，4］。本實(shí)驗(yàn)以高膽固醇飲食誘發(fā)豚鼠膽結(jié)石，采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry， FCM）測定實(shí)驗(yàn)豚鼠膽囊細(xì)胞鈣離子濃度［Ca2+］i，以探討?zhàn)B肝柔肝中藥防治膽囊結(jié)石形成的作用機(jī)制。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用白色、紅目豚鼠，雌雄各半，清潔級，體質(zhì)量（220±20）g，共80只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

　　1.2 主要試劑、藥物與儀器

　　1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和藥物 Fluo-3，AM熒光染料，美國Molecular Probes公司產(chǎn)品；養(yǎng)肝柔肝中藥采用養(yǎng)肝利膽顆粒（何首烏、枸杞子、白芍藥、陳皮、甘草），8 g/包，每克相當(dāng)于含原藥材4.5 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院制劑室提供；熊去氧膽酸 （ursodeoxycholic acid， UDCA），上海三維長江生化制藥廠產(chǎn)品，批號為200304005，10 mg/片。

　　1.2.2 主要儀器 Mgna FTIR-750型紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司產(chǎn)品；LG-10低溫高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品；Facscalibour流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

　　1.3 動物分組、造模及藥物處理 所有豚鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心動物室，室溫（23±10）℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，無懷孕及不良反應(yīng)，飲食、飲水正常者，即納入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)豚鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、熊去氧膽酸組和養(yǎng)肝柔肝中藥組，每組各20只。采用高膽固醇致石食餌誘發(fā)法建立豚鼠膽囊膽固醇結(jié)石動物模型［5］，正常對照組喂正常飼料及青菜適量，模型組喂以致石飼料及少量青菜，各治療組在喂以相當(dāng)于模型組的致石飼料及青菜的同時給以藥物灌胃。藥物以成人用藥劑量（ 60 kg 體質(zhì)量，養(yǎng)肝利膽顆粒18 g/d、UDCA 300 mg/d） 按體型系數(shù)換算［6］，養(yǎng)肝柔肝中藥組給以養(yǎng)肝利膽顆粒1.81 g/（kg.d），熊去氧膽酸組給以UDCA 30.12 mg/（kg.d），模型組和正常對照組豚鼠灌胃等容量的生理鹽水，連續(xù)7周。

　　1.4 標(biāo)本采集與處理

　　1.4.1 標(biāo)本采集 各組動物均于第7周末取材。 以15%烏拉坦腹腔注射麻醉，活體下肉眼觀察膽汁中成石情況，然后完整切除膽囊后，再仔細(xì)觀察膽囊內(nèi)成石情況，收集膽石。完整切除膽囊后冷凍保存標(biāo)本。

　　1.4.2 標(biāo)本處理 取豚鼠膽囊修剪成米粒大小，用醫(yī)用剪刀剪碎，同時不斷用PBS沖洗，獲得細(xì)胞懸液后用40 μm的尼龍網(wǎng)過濾，再用PBS沖洗兩遍， 1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至每管106個細(xì)胞，分別加入A、B管中，在A管中加入PBS，B管中加入Fluo-3熒光素，混勻后放在暗處，室溫下靜止45 min，PBS沖洗一遍上機(jī)待測。

　　1.5 膽石紅外光譜定性 采用溴化鉀壓片法測定膽結(jié)石樣品。

　　1.6 膽囊細(xì)胞［Ca2+］i的測定 參考文獻(xiàn)［7］，使用Facscalibour流式細(xì)胞儀檢測，利用CELL-Quelt功能軟件進(jìn)行參數(shù)的獲取和數(shù)據(jù)分析。

　　1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料用 x ±s 表示，組間均數(shù)比較采用方差分析。計數(shù)資料采用率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)方法。所有運(yùn)算程序均在計算機(jī)上運(yùn)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行。

　　2 結(jié)果

　　2.1 豚鼠大體情況 正常對照組豚鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量自然增加，反應(yīng)靈活，活動敏捷，被毛密集而有光澤、緊貼皮膚，鼻、唇濕潤清潔，眼睛明亮，大便正常，在飼養(yǎng)過程中無死亡。模型組動物表現(xiàn)飲食減少，生長緩慢，被毛干枯、蓬松且易脫落，活動遲緩，反應(yīng)遲鈍，眼睛、鼻、唇、耳、尾部色淡少澤。熊去氧膽酸組和養(yǎng)肝柔肝中藥組豚鼠行為學(xué)表現(xiàn)、體質(zhì)量和營養(yǎng)狀況等方面與模型組比較有明顯改善，但不能恢復(fù)到正常對照組水平。模型組豚鼠在造模30 d后有3只動物死亡，經(jīng)解剖膽囊發(fā)現(xiàn)有2只豚鼠膽囊發(fā)生結(jié)石。養(yǎng)肝柔肝中藥組、熊去氧膽酸組各有 2只 動物死亡，這兩組死亡豚鼠經(jīng)解剖膽囊均未發(fā)現(xiàn)明顯結(jié)石生成。由于上述三組共計7只豚鼠死時未達(dá)造模的時間要求，所以沒有計入成石率的結(jié)果，也未作為標(biāo)本采集的來源。

　　2.2 膽石定性 肉眼所見膽囊結(jié)石呈膽石泥砂或絮狀沉淀。經(jīng)紅外光譜檢測分析為膽固醇結(jié)石。

　　2.3 豚鼠膽囊結(jié)石生成情況 以肉眼觀察可見膽囊內(nèi)有塊狀及絮狀沉淀物并經(jīng)紅外光譜鑒定為膽固醇結(jié)石。正常對照組中1只動物無膽囊而沒有計入成石率的統(tǒng)計，其余19只動物中有1只發(fā)生膽石，成石率為5.26%.模型組動物中除3只死亡外，其余17只動物中有14只出現(xiàn)膽石，成石率為 82.35% ，明顯高于正常對照組（ P <0.01）。養(yǎng)肝柔肝中藥組18只動物中有5只出現(xiàn)膽石，熊去氧膽酸組18只動物中有7只出現(xiàn)膽石，養(yǎng)肝柔肝中藥組和熊去氧膽酸組成石率分別為27.78%和38.89%，均明顯低于模型組膽石生成率（ P <0.05）。

　　2.4 膽囊細(xì)胞［Ca2+］i測定結(jié)果 隨機(jī)抽取保存的豚鼠膽囊組織，上述4組每組各8份，測定各組膽囊細(xì)胞［Ca2+］i.正常對照組膽囊細(xì)胞［Ca2+］i為（82.77±12.45）nmol/L，模型組為（18.52± 11.97）nmol/L ，熊去氧膽酸組為（44.79± 8.94）nmol/L ，養(yǎng)肝柔肝中藥組為（72.86± 10.68）nmol/L .結(jié)果顯示，模型組膽囊細(xì)胞［Ca 2+］i較正常對照組明顯降低（ P <0.01）；養(yǎng)肝柔肝中藥組和熊去氧膽酸組均可升高膽囊細(xì)胞［Ca2+］i，與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）；但養(yǎng)肝柔肝中藥組與正常對照組無明顯差異（ P > 0.05 ），熊去氧膽酸組與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）；養(yǎng)肝柔肝中藥組與熊去氧膽酸組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）。

　　3 討論

　　隨著人口的老齡化與飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國膽結(jié)石的患病種類發(fā)生了很大的變化，尤其是近20年來，膽囊結(jié)石約占膽石病發(fā)病的80%［8］，以膽固醇為主要成分的膽囊結(jié)石已成為我國膽結(jié)石的主要類型［1，9］。因此，我們在本研究中選擇了高膽固醇致石食餌誘發(fā)法建立豚鼠膽固醇結(jié)石的動物模型。朱培庭教授［3］在總結(jié)我院著名中醫(yī)外科專家顧伯華教授和中西醫(yī)結(jié)合專家徐長生教授治療膽石病經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對274例慢性膽道感染、膽石病病人進(jìn)行辨證分析發(fā)現(xiàn)，肝陰不足證型占66.66%，并且50歲以上年齡者高達(dá)72.37%，這與《內(nèi)經(jīng)》“年四十而陰氣自半也，起居衰矣”（《素問。陰陽應(yīng)象大論》）的理論及朱丹溪“陽常有余，陰常不足”之論相吻合。對肝陰不足證型膽石病患者予驗(yàn)方養(yǎng)肝利膽方藥治療顯示了良好的效果，有效率達(dá)84.13%［3，4］。養(yǎng)肝利膽顆粒劑由何首烏、枸杞子、白芍、陳皮、甘草等組成。方以何首烏、枸杞子、白芍滋養(yǎng)肝陰。其中何首烏補(bǔ)肝腎、益精血；枸杞子味甘平而潤，性滋而補(bǔ)，能生精益氣；白芍苦酸微寒，能養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛；陳皮苦辛溫，能理氣健脾，且能防滋陰藥過于滋膩之弊。縱覽全方切合疏肝利膽的治療大法，體現(xiàn)了“膽病從肝論治”之學(xué)術(shù)思想。在平滑肌收縮與舒張的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中，細(xì)胞 內(nèi)游離鈣作為一種重要的第二信使廣泛地參與細(xì)胞的運(yùn)動、分泌、代謝和分化等多種細(xì)胞功能活動的調(diào)節(jié)。［Ca2+］i的降低是平滑肌細(xì)胞舒張的關(guān)鍵因素之一，調(diào)節(jié)平滑肌收縮的主要蛋白有肌球蛋白輕鏈、原肌球蛋白和調(diào)鈣蛋白的結(jié)合蛋白等。平滑肌細(xì)胞中收縮相關(guān)蛋白參與平滑肌細(xì)胞收縮、收縮的調(diào)節(jié)及細(xì)胞骨架的構(gòu)成，這些蛋白的活性在一定程度上均受到［Ca2+］i的調(diào)節(jié)［10，11］。已有研究表明，膽囊平滑肌細(xì)胞［Ca2+］i的降低，是導(dǎo)致平滑肌收縮功能障礙的重要原因。本研究表明，模型組豚鼠膽囊細(xì)胞［Ca2+］i明顯降低，養(yǎng)肝柔肝中藥不僅能有效降低膽結(jié)石的生成，而且可明顯提高膽囊細(xì)胞［Ca2+］i.膽囊細(xì)胞［Ca2+］i通過與相關(guān)鈣結(jié)合蛋白結(jié)合，間接調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化，對細(xì)胞外信號作出應(yīng)答，以增強(qiáng)膽囊平滑肌細(xì)胞的收縮，減輕膽汁淤滯，這可能是養(yǎng)肝柔肝中藥治療膽石病作用的重要機(jī)制之一。

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