【關鍵詞】  內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； 衣霉素； 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78； 凋亡促進因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白； 小鼠

　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum， ER）廣泛存在于真核細胞中，是蛋白質(zhì)合成、折疊、運輸以及細胞內(nèi)鈣離子儲存的主要場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子紊亂和未折疊蛋白質(zhì)蓄積可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress， ERS），發(fā)生具有保護作用的未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激直接影響應激細胞的轉(zhuǎn)歸，如修復、損傷或凋亡。神經(jīng)系統(tǒng)許多疾病與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關。最近的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡信號傳導途徑可能與阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）的發(fā)病有關。本研究觀察滋補脾陰方藥（Zibu Piyin Recipe， ZBPYR）含藥血清對由N糖鏈抑制劑衣霉素（tunicamycin， Tm）引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，以探討其神經(jīng)保護機制。

　　1  材料與方法

　　1.1  實驗藥物  滋補脾陰方藥由清代吳澄《不居集》中資成湯加味而成，由紅參30 g，山藥15 g，茯苓15 g，白芍15 g，丹參12 g，白扁豆15 g，蓮肉20 g，石菖蒲10 g，遠志10 g，檀香4.5 g，橘紅9 g，甘草9 g組成，均購自大連醫(yī)藥集團藥材公司。中藥常規(guī)水煎，每毫升中藥液含生藥3.29 g，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　1.2  主要試劑和儀器  達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco‘s modified eagle’s medium， DMEM）和胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶和TRIReagent，Sigma公司產(chǎn)品；Tm，星形孢菌素（staurosporine， STS），日本W(wǎng)ako公司產(chǎn)品；細胞毒性檢測試劑盒，Roche公司產(chǎn)品；RNase OUT和Oligo （dt），Invitrogen公司產(chǎn)品。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，Thermo Forma公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機，Sigma公司產(chǎn)品；UV754紫外分光光度計，上海分析儀器總廠產(chǎn)品；溫度梯度PCR擴增儀，Thermo Hybaid公司產(chǎn)品；酶標儀，美國BIOTEKTM公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，UVP公司產(chǎn)品。

　　1.3  中藥血清制備  取健康雄性SD大鼠（220～250 ｇ）12只，隨機分為對照組和ZBPYR組，每組6只。適應飼養(yǎng)3 d后，ZBPYR組給予滋補脾陰方藥灌胃，10 ml/kg體質(zhì)量，此劑量灌胃2次/d，連續(xù)3 d；對照組給予等體積生理鹽水灌胃。于末次給藥后1 h腹主動脈取血，靜置2 h，2 000 r/min，4 ℃離心15 min分離血清，離心半徑為16.1 cm，56 ℃，30 min滅活。0.22 μm濾膜過濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　1.4  Neuro2a細胞的培養(yǎng)  小鼠神經(jīng)瘤母細胞Neuro2a細胞株由日本北海道大學藥學部野村靖幸教授惠贈。細胞常規(guī)復蘇后加入培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞單層長滿后用終濃度為0.25%胰蛋白酶37 ℃條件下消化3 min，以1∶3傳代。培養(yǎng)液含90% DMEM、10%胎牛血清和1％雙抗。細胞長至第三代可以使用。

　　1.5  乳酸脫氫酶釋放試驗  Neuro2a細胞接種后分為對照組、10％空白血清組、5％ZBPYR組、10％ZBPYR組、15％ZBPYR組、Tm（5 μg/ml）組、10％空白血清＋Tm（5 μg/ml）組、5％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）組、10％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）組、15％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）組。細胞單層長至70％時按以上分組給予相應刺激。刺激后細胞放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）釋放試驗檢測LDH泄漏率。LDH實驗步驟按試劑盒說明執(zhí)行。LDH泄漏率為細胞上清中LDH活性與細胞總的LDH活性比值。LDH活性測定用酶標儀于490 nm處檢測。另外Neuro2a細胞接種后分為對照組、STS（0.1 μmol/L）組、10％空白血清＋STS（0.1 μmol/L）組、15％ ZBPYR＋STS（0.1 μmol/L）組，待細胞單層長至70％時按以上分組給予相應刺激。刺激后細胞放入5％ CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測LDH泄漏率。

　　1.6  逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應  實驗分組同前。細胞單層長至90％時按以上分組給予相應刺激。細胞放入5％ CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h.總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應。（1）收集細胞用TRIReagent提取總RNA.用紫外分光光度計測定A260/A280，計算RNA濃度。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應。反應體系為20 μl.取2 μg總RNA，加二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate， DEPC）水至總體積為9 μl，加0.5 μl Oligo （dt） 1218引物混合后，置70 ℃變性10 min.然后加入下列成分：5×第一鏈緩沖液5.875 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl、RNase抑制劑0.5 μl和逆轉(zhuǎn)錄酶0.125 μl，混合使反應總體系為20 μl.放入46 ℃反應1.5 h，70 ℃變性15 min，冰上5 min后進行擴增。（3）PCR反應。在0.2 ml PCR管中加入1.2  μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、sd H2O 9 μl、10 mmol/L dNTP 0.24 μl、10×PCR緩沖液1.2 μl、聚合酶0.12 μl、上游引物（20 μmol/L）0.12 μl、下游引物（20 μmol/L）0.12 μl，總反應體系為12 μl.（4）PCR產(chǎn)物觀察。PCR產(chǎn)物經(jīng)40％丙烯酰胺凝膠電泳后，EB染色15 min，用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照及圖像分析，然后計算待測基因與內(nèi)標磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase， GAPDH）吸光度的比值。PCR反應擴增參數(shù)如下：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78， GRP78），94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)22圈，72 ℃ 5 min；凋亡促進因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/EBP homologous protein， CHOP），94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)25圈，72 ℃ 5 min；GAPDH，94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)28圈，72 ℃ 5 min.引物序列見表1.

　　表1  引物序列（略）

　　Table 1  Sequence of the primers

　　1.7  統(tǒng)計學方法  每組實驗重復4次，圖像分析采用LabWorks 4.6專業(yè)圖像分析軟件。數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行分析，兩組間差異比較采用t檢驗。

　　2  結(jié)果

　　2.1  LDH釋放試驗檢測ZBPYR含藥血清對Tm刺激Neuro2a后LDH泄漏率的影響  各濃度含藥血清和10%空白血清組與對照組相比，LDH泄漏率差異沒有統(tǒng)計學意義，說明血清對Neuro2a細胞沒有毒性作用；Tm（5 μg/ml）組與對照組相比，LDH泄漏率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；10％空白血清預處理組LDH泄漏率與Tm組相比，差異無統(tǒng)計學意義；而各濃度ZBPYR含藥血清預處理組與Tm組相比，LDH泄漏率下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。10％藥物血清預處理組與10％空白血清預處理組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1.

　　2.2  RTPCR方法觀察ZBPYR含藥血清對Tm刺激Neuro2a后GRP78 mRNA表達的影響  各濃度含藥血清和10%空白血清組與對照組相比，GRP78 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，說明血清對Neuro2a細胞GRP78 mRNA表達沒有影響；Tm（5 μg/ml）組與對照組相比，GRP78 mRNA表達明顯增強（P＜0.05）；而加入血清預處理1 h后再加入濃度為5 μg/ml Tm各組與Tm（5 μg/ml）組相比，GRP78 mRNA表達明顯下降（P＜0.05），其中ZBPYR含藥血清預處理組GRP78 mRNA表達較空白血清預處理組GRP78 mRNA表達下降更加明顯（P＜0.05）。見圖2.

　　2.3  RTPCR方法觀察ZBPYR含藥血清對Tm刺激Neuro2a后CHOP mRNA表達的影響  各濃度含藥血清組與對照組相比，CHOP mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，說明血清對Neuro2a細胞CHOP mRNA表達沒有影響；Tm（5 μg/ml）組與對照組相比，CHOP mRNA表達增強（P＜0.05）；10％空白血清預處理組與Tm（5 μg/ml）組相比，CHOP mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義；而各濃度ZBPYR含藥血清預處理組CHOP mRNA表達與Tm（5 μg/ml）組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；10％藥物血清預處理組與10％空白血清預處理組相比，CHOP mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2.

　　圖1  LDH檢測Tm刺激細胞后各組細胞LDH泄漏率（略）

　　Figure 1  LDH leakage from each group treated by Tm

　　**P＜0.01， vs normal control group； △P＜0.05， △△P＜0.01， vs Tmtreated group； ▲P＜0.05， vs 10％ control serumtreated group （n=4 for each group）。

　　圖2  RTPCR法觀察Tm刺激各組細胞后GRP78和CHOP mRNA表達（略）

　　Figure 2  Expressions of GRP78 and CHOP mRNAs in different groups treated by Tm （RTPCR）

　　Results of RTPCR electrophoresis from each group and values of IOD from each group （n=4 for each group）。 *P＜0.05， vs normal control group； △P＜0.05， vs Tmtreated group； ▲P＜0.05， vs 10％ control serumtreated group.

　　2.4  LDH釋放試驗檢測STS刺激Neuro2a后LDH泄漏率的變化  STS 0.1 μmol/L組與對照組比，LDH泄漏率升高（P＜0.01）；而加入15％空白血清預處理組與STS組相比，LDH泄漏率下降（P＜0.05）；15％ ZBPYR含藥血清預處理組與STS組相比，LDH泄漏率下降（P＜0.01）；15％ ZBPYR含藥血清預處理組與15％空白血清預處理組相比LDH泄漏率下降更加明顯（P＜0.05）。見圖3.

　　圖3  LDH檢測STS刺激細胞后各組細胞LDH泄漏率（略）

　　Figure 3  LDH leakage from each group treated by STS

　　**P＜0.01， vs normal control group； △P＜0.05， △△P＜0.01， vs STStreated group； ▲P＜0.05， vs 15％ control serumtreated group （n=4 for each group）。

　　3  討論

　　ERS是細胞的一種應激反應過程，糖饑餓、鈣平衡紊亂、糖基化抑制和二硫鍵合成減少等情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微環(huán)境發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的折疊受到影響，導致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，由此引起一系列以分子伴侶和折疊酶表達上調(diào)為標志的應答反應，稱為未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）。通過UPR細胞才能在應激情況下存活。分子伴侶GRP78與凋亡促進因子CHOP是ERS時表達增多的兩種分子，被看作是ERS的標志，在ERS中起著不同的作用。其中GRP78能保護細胞，而CHOP則是促進細胞凋亡。因此通過藥物干預后研究它們的表達情況可以進一步了解藥物對ERS的作用。AD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，病理特征為淀粉樣蛋白的沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、tau蛋白異常磷酸化和區(qū)域選擇性神經(jīng)元死亡［1］。AD與基因突變有關，主要有編碼淀粉樣蛋白前體基因（amyloid protein precursor， APP）和早老素（presenilin， PS）基因，這些基因都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關。AD相關的早老素突變，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應并且通過改變APP的蛋白水解加工作用而部分地增強對應激誘導的凋亡的易損性。PS1突變通過細胞表面有活性的鈣離子流入的直接減少，不依賴APP，并間接地通過APP處理作用和淀粉樣肽的產(chǎn)生增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放來解除對神經(jīng)元鈣離子穩(wěn)態(tài)的控制。這種鈣離子穩(wěn)態(tài)的干擾將改變APP的加工，過量生成β淀粉樣蛋白142（amyloid βprotein 142， Aβ142），同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣失衡，激活鈣蛋白激酶，切割內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的caspase12，從而激活caspase12介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡路徑，最終形成AD的病理變化［2］。除了鈣離子失調(diào)，PS突變下調(diào)UPR并增強對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的易損性［3］。PS1突變還誘導了一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與應激介導的凋亡途徑有關的凋亡前因子CHOP的表達［4］。PS是γ分泌酶復合物的一部分，與β分泌酶一起，裂解APP產(chǎn)生Aβ，并且PS突變增加總Aβ和Aβ142的產(chǎn)生。Aβ能直接引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子釋放并且誘導了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和神經(jīng)毒性［5］。因而，在AD中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是引發(fā)和調(diào)節(jié)神經(jīng)元死亡的一個主要事件?，F(xiàn)有研究顯示在AD神經(jīng)元死亡中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑和線粒體損傷的凋亡途徑相互影響，起著調(diào)控凋亡級聯(lián)反應的作用［6］。中醫(yī)認為人體的生長、發(fā)育和衰老與“腎”密切相關?！澳I精虛衰”是衰老的主要原因。同時又認為“脾胃為血氣陰陽之根蒂”，“脾胃既和，其人壽；脾胃不和，其人夭”，因此也重視奉養(yǎng)脾胃精氣在延年中的作用［7］。老年癡呆發(fā)病于老年期。老年期脾胃氣衰，飲食減少，脾虛則化源不足，腦髓失養(yǎng)，神機失調(diào)而發(fā)為本病。因此脾虛是老年性癡呆的基本病機，脾的功能衰退在老年性癡呆發(fā)病過程中起著主導作用，并貫穿于全過程［8］。脾的生理功能是脾之陰陽共同作用的結(jié)果。脾陰是指存在于脾臟的陰液（包括血、津液和水谷精微等）和脾的物質(zhì)形態(tài)及其滋潤濡養(yǎng)功能。由于脾與大腦關系密切，脾陰虧虛嚴重影響大腦的意識、學習、思維、記憶和情緒等功能，導致一系列與腦相關的精神意識病證如意識不清、學習記憶能力下降和情緒失常等。因此，滋補脾陰應當是防治老年癡呆的一個重要措施。滋補脾陰方藥由清代吳澄《不居集》中資成湯加味而成，以人參補脾益氣生津，山藥益胃補脾養(yǎng)陰，白芍養(yǎng)陰緩急，丹參活血養(yǎng)血益陰，茯苓健脾安神益智等，共奏健脾益陰之效。本組以往的研究顯示，滋補脾陰方藥能通過改善老齡大鼠腦細胞線粒體膜Na+K+ATP酶、Ca2+Mg2+ATP酶活性，調(diào)節(jié)膜磷脂代謝障礙和修飾膜的作用［9］，以及延緩興奮性氨基酸受體N甲基D門冬氨酸（NmethylDaspartic acid， NMDA）受體、γ氨基丁酸（gammaaminobutyric acid， GABA）受體染色陽性神經(jīng)元在衰老過程中喪失，同時抑制神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）的表達，起到神經(jīng)保護、延緩腦衰老的作用［10］。本實驗中Tm刺激Neuro2a細胞LDH釋放試驗結(jié)果表明，在加入滋補脾陰方藥含藥血清預保護后，可以明顯降低Tm刺激細胞后的LDH泄漏率，結(jié)合RTPCR觀察到滋補脾陰方藥含藥血清預處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物GRP78及CHOP mRNA的表達受到抑制，兩種實驗結(jié)果的同步性可以推斷滋補脾陰方藥具有抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用。STS刺激Neuro2a細胞LDH釋放試驗結(jié)果表明，加入滋補脾陰方藥含藥血清預處理后，可以明顯降低STS刺激細胞后的LDH泄漏率（STS是線粒體凋亡途徑誘導劑）。因而表明滋補脾陰方藥同時具有保護線粒體損傷的作用。以上的研究結(jié)果為滋補脾陰方藥應用于臨床防治AD提供了依據(jù)。AD是一種常見的神經(jīng)退行性病變，其發(fā)病機制復雜，目前尚無有效的治療手段，對社會和人們的生活造成嚴重的負擔。現(xiàn)有的研究表明，神經(jīng)元的凋亡在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑和線粒體損傷的凋亡途徑已被證明在AD的發(fā)病過程中起著協(xié)同作用。我們的實驗證明，滋補脾陰方藥對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑和線粒體損傷的凋亡途徑具有雙重作用，因而有助于AD的防治，加之中藥治療有著毒副作用低、經(jīng)濟實惠的優(yōu)點，更易于為人們所接受。

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