【摘要】  建立脾腎虛型重癥肌無力患者血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，觀察脾腎虛型重癥肌無力患者與正常人血清蛋白質(zhì)差異表達情況。方法：采用反復凍融法抽提血清蛋白質(zhì)，以優(yōu)化的雙向電泳技術分離血清蛋白質(zhì)，建立脾腎虛型重癥肌無力患者與正常人血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，并采用二維電泳圖譜專用軟件對所得結果進行圖譜分析。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜法對兩組間比較所得目標蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜鑒定。結果：通過雙向電泳，建立血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，選取具有明顯差異的蛋白點21個進行質(zhì)譜鑒定，共鑒定出8種蛋白質(zhì)。結論：通過蛋白質(zhì)組技術快速建立脾腎虛型重癥肌無力患者血清蛋白表達圖譜及質(zhì)譜分析，可為進一步研究其發(fā)病機制及治療手段提供實驗基礎。

　　【關鍵詞】  重癥肌無力； 蛋白質(zhì)組； 電泳； 乙酰膽堿受體

　　重癥肌無力（myasthenia gravis， MG）主要是由乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor， AchR）抗體介導的，補體參與，細胞免疫依賴性，針對神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體的自身免疫性疾病。對于MG的治療至今仍缺乏有效手段。蛋白質(zhì)組技術利用其核心技術雙向電泳（two-dimen-sional gel electrophoresis， 2-DE）對組織或細胞總蛋白質(zhì)進行分離［1］，并通過正常與疾病組織的差異表達蛋白比較，找到與該疾病相關的蛋白質(zhì)分子。本研究通過建立脾腎虛型重癥肌無力患者和正常人血清總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜，尋找有明顯差異性表達的蛋白，對差異表達的蛋白進行鑒定和研究，為進一步研究MG發(fā)病機制以及MG診斷治療提供實驗基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1 血清采集 MG患者全血來自2004～2005年就診于遼寧中醫(yī)學院附屬醫(yī)院的門診患者。根據(jù)典型臨床表現(xiàn)、新斯的明試驗、低頻重復電刺激及單纖維肌電圖等確診，無其他自身免疫性疾病，未經(jīng)其他免疫抑制治療，并參照1994年版《中醫(yī)病證診斷療效標準》辨證為脾腎虛型。正常人血清取自同時期健康志愿者。-70 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/P>

　　1.2 主要試劑 固相pH梯度干膠條IPG strip（Amersham公司產(chǎn)品， 非線性pH 3～10， 7 cm）。3-［3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸鹽｛3-［（3-cholamidopropyl） dimethylamino］-1-propanesul-fonate， CHAPS｝，二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol， DTT），三丁基膦（tributyl phosphine， TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide， IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲雙丙烯酰胺（N， N‘-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N， N， N， N-tetram-ethyl-ethylenediamine， TEMED），過硫酰胺（am-monium persulfate， APS），三羥甲基氨基甲烷［tris （hydroxymethyl） aminomethane］、甘氨酸（glycine， Gly）和十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。瓊脂糖為華美生物公司產(chǎn)品。其他試劑均使用國產(chǎn)分析純試劑。所有溶液均用MilliQ水配制。

　　1.3 主要儀器 高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司產(chǎn)品；P-2000分光光度儀，Hitachi公司產(chǎn)品；SE-600電泳儀，Amersham公司產(chǎn)品；純水裝置，Millipore公司產(chǎn)品；GS-710光密度掃描儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；冷卻水循環(huán)系統(tǒng)，Cole-Parmer公司產(chǎn)品；Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美國Bruker-Daltonics公司產(chǎn)品；LCQ Deca XP Plus，美國Thermo Finnigan公司產(chǎn)品。

　　1.4 雙向電泳

　　1.4.1 血清總蛋白質(zhì)的提取及定量 血清-70 ℃反復凍融4次后，用Agilent Multiple Affinity Re-moval Column處理去除高豐度蛋白。使用Agilent 5K超濾管進行濃縮除鹽，凍干回收的樣品，-70 ℃保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和cocktail酶抑制劑）進行復溶，并采用考馬斯亮藍法進行蛋白質(zhì)定量。

　　1.4.2 等電聚焦 自-20 ℃取出的膠條，室溫下平衡10 min，以500 μg上樣量在每份樣本中加入上樣緩沖液（8 mol/L尿素、2% CHAPS、1% Bio-lyte和1% TBP）以及標準蛋白質(zhì)分子，上樣于泡脹槽中，加入礦物油覆蓋。程序設置如下：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h.恒溫20 ℃。等電聚焦電泳后IPG膠條在平衡液1（Tris-base 50 mol/L 、尿素 6 mol/L、甘油 30%、SDS 2%、溴酚藍0.002%和DTT 100 mg）中于振蕩器上振蕩 15 min； 然后置入平衡液2（成分同平衡液1，用 400 mg 碘乙酰胺代替100 mg DTT）同樣于振蕩器上振蕩15 min.

　　1.4.3 SDS-PAGE垂直電泳 采用12.5%的均勻SDS2聚丙烯酰胺凝膠（水23.2 ml，30%丙烯酰胺溶液32.46 ml，1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液pH 8.8 20 ml，10% SDS 0.8 ml，10% APS 0.4 ml，TEMED 3.76 μl，膠總體積80 ml）。將平衡后的IPG膠條移至凝膠的上方，膠條一端放入低分子量蛋白質(zhì)標準，0.5%的瓊脂糖封膠。上下槽加入電極緩沖液（Tris 5 mmol/L，Gly 192 mmol/L和SDS 0.1%）。初始電流為每塊膠40 mA，電泳20 min，然后以每塊膠60 mA電流，直至溴酚藍前沿。

　　1.4.4 銀染色 電泳結束后，采用硝酸銀染色法，通過固定，硝酸銀染色，顯影，停顯及脫色，至背景清晰。

　　1.5 圖像分析 每個樣品常規(guī)進行3次二維電泳，用GS-710光密度掃描儀對電泳后的膠圖分別進行掃描，所得掃描圖像輸入計算機，采用Image-master軟件對圖像進行背景消減、蛋白質(zhì)點檢測和校正，獲取蛋白質(zhì)點的位置坐標和表達量等分析。選取 Ratio ≥1.5的蛋白質(zhì)點認為有差異。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均采用SPSS 12.0軟件，統(tǒng)計學分析采用 t 檢驗。

　　1.6 基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜分析 用手術刀片切下膠上目標條帶，進行切膠、膠上胰蛋白酶酶解 20 h ，抽提酶解肽段，Zip Tip脫鹽后點樣，行基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）分析（飛行管長2.7 m，加速電壓 20 kV ，反射電壓23 kV）。將第1級質(zhì)譜得到的肽片段質(zhì)量指紋圖譜、肽質(zhì)量指紋圖譜與第2級質(zhì)譜得到的肽序列信息一起用來檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，找出匹配的蛋白質(zhì)。

　　1.7 數(shù)據(jù)庫檢索 將質(zhì)譜鑒定所得的肽質(zhì)量指紋譜（peptide mass fingerprinting， PMF）數(shù)據(jù)于Bio-Works（Thermo Finnigan， San Jose， CA）軟件搜索相應的庫。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為IPI human蛋白庫（SEQUEST結果過濾參數(shù)為：當Charge+1，Xcorr≥1.9；當Charge+2，Xcorr≥2.2；當Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1）以及NCBI上 Homo sapiens的非冗余蛋白庫（redundant data-base）。檢索參數(shù)為胰蛋白酶解；氨基酸固定修飾方式為脲甲基半胱氨酸；模式為單同位素峰；肽片斷最大誤差控制在100 ppm；肽片斷最大分子量誤差為±0.5 Da；每個肽允許有1個不完全裂解位點。

　　2 結果

　　2.1 脾腎虛型重癥肌無力患者血清雙向電泳圖譜 的建立及分析 經(jīng)2-DE技術及銀染色后，得到了兩組血清的雙向凝膠電泳圖，并于相同的條件下重復實驗3次。在正常對照組細胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜上可觀察到1 463±179個蛋白點，而脾腎虛型重癥肌無力組可見到1 508±89個蛋白點。見圖 1～3 .

　　2.2 差異蛋白質(zhì)點的鑒定和功能分析 通過對 2-DE 凝膠上差異表達的21個蛋白質(zhì)斑點進行切割，用胰蛋白酶消化后進行MALDI-TOF-MS檢測。 21個 點中獲得了13張PMF（圖4），另有8個蛋白質(zhì)點未獲得PMF.將查詢到的結果再結合 2-DE 圖譜上相應蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和PI值等進行綜合分析，在獲得的13張PMF數(shù)據(jù)中有5個無可信搜索結果。在數(shù)據(jù)庫中匹配到符合結果要求的已知蛋白質(zhì)有 8個 .本次檢測的8個質(zhì)點在脾腎虛型重癥肌無力患者血清圖譜中表達均增加，且差異都具有統(tǒng)計學意義。鑒定的8個質(zhì)點分別為：載脂蛋白A-I（1382號及1438號質(zhì)點）、白蛋白、胎球蛋白B的前體、載脂蛋白E的前體、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白前體、泰素耐藥相關基因-3和前血清淀粉樣蛋白P成分。這些蛋白分布廣泛，并具有重要生物學功能。見表1 和2.

　　圖1 正常人血清雙向電泳圖譜（略）

　　Figure 1 Two-dimensional electrophoresis map of normal persons‘ serum

　　圖2 脾腎虛型重癥肌無力患者血清雙向電泳圖譜（略）

　　Figure 2 Two-dimensional electrophoresis map of MG patients‘ serum

　　圖3 正常人和脾腎虛型重癥肌無力患者血清蛋白差異性比較局部放大圖（略）

　　Figure 3 Augmented figure of differentially expressed proteins （comparison between MG group and normal group）

　　圖4 772號樣品肽指紋圖譜（略）

　　Figure 4 Peptide mass fingerprinting of Sample 772

　　表1 通過MALDI-TOF-MS質(zhì)譜IPI human蛋白庫搜索情況列表（略）

　　Table 1 Differentially expressed proteins between MG patients and normal persons identified by2-DE and MALDI-TOF-MS or ESI-MS analysis of IPI human

　　表2 通過MALDI-TOF-MS質(zhì)譜NCBI非冗余蛋白庫搜索情況列表（略）

　　Table 2 Differentially expressed proteins between MG patients and normal persons identified by2-DE and MALDI-TOF-MS or ESI-MS analysis of NCBI

　　3 討論

　　免疫功能調(diào)節(jié)異常是重癥肌無力重要發(fā)病機制之一。現(xiàn)已證實，AchR-ab阻滯降解突觸后膜受體，使自身抗原主要為煙堿型乙酰膽堿受體活性降低，突觸后膜表面積減少，神經(jīng)-肌肉接頭傳遞障礙，出現(xiàn)肌無力癥狀，T細胞在該免疫應答過程中起關鍵作用［2，3］。90%以上病人血清中可檢出AchR-ab［4］。AchR-ab已成為最重要的MG實驗室診斷檢測指標。該疾病與遺傳也有密切關系。重癥肌無力需要長期治療，且藥物毒副作用大［5］。重癥肌無力屬中醫(yī)“瘺證”范疇，是以眼瞼下垂，四肢軟弱無力，晨輕暮重，漸進性加重或伴有吞咽困難、構音不清為特征的疾病。其根本病機是脾腎虧虛。蛋白質(zhì)組技術包括蛋白分離技術和鑒定技術，也即主要通過2-DE或二維液相色譜分析等蛋白質(zhì)分離技術，建立蛋白質(zhì)組圖譜，并應用表面增強激光解吸電離或基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜技術，并結合飛行時間-質(zhì)譜系統(tǒng)對結合的蛋白質(zhì)或多肽進行質(zhì)譜分析鑒定。雙向電泳技術是蛋白質(zhì)組研究的核心技術［6～8］。2-DE技術最大的優(yōu)勢在于它可以對細胞或組織內(nèi)復雜的蛋白質(zhì)組分進行整體性分析，從而可以分析不同生理和病理條件下蛋白質(zhì)組的表達變化。本研究通過雙向電泳技術，成功建立了脾腎虛型重癥肌無力患者血清2-DE圖譜。其中在正常對照組細胞蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜上觀察到了1 463±179個蛋白點，而重癥肌無力組共觀察到1 508±89個蛋白點。PMF是對蛋白酶解或降解后所得到的多肽片段質(zhì)量圖譜。對質(zhì)譜分析所得肽片與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論肽片進行比較，從而判別所測蛋白是已知還是未知，并在一定質(zhì)量誤差范圍內(nèi)記錄每個蛋白質(zhì)肽質(zhì)量理論值與樣品蛋白質(zhì)肽質(zhì)量測定值相符的數(shù)目，理論值與測定值相符數(shù)量最多的蛋白質(zhì)即可能為需鑒定的樣品蛋白質(zhì)。由于不同的蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白質(zhì)所得肽片具有指紋的特征。應用肽質(zhì)指紋數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)庫搜索是PMF分析蛋白質(zhì)的最后一步，本研究所鑒定的21個點中共獲得了13張肽質(zhì)量指紋圖譜，并在相應數(shù)據(jù)庫中對蛋白進行了檢索。本研究初步鑒定的蛋白質(zhì)點中，在數(shù)據(jù)庫中匹配到符合結果要求的已知蛋白質(zhì)有8個。這8個點在重癥肌無力患者血清圖譜中表達均增加。具體而言，脾腎虛型重癥肌無力患者載脂蛋白A-I、載脂蛋白E的前體蛋白、白蛋白、胎球蛋白B的前體、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白前體、泰素耐藥相關基因-3和前血清淀粉樣蛋白P成分均明顯高于正常人。這些蛋白大都與物質(zhì)代謝相關，能促進肌肉淀粉樣變。1587號轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白是含4個相同子單元的四聚體，在單體的情況下可形成淀粉樣纖維，造成組織纖維化，并最終導致肌無力及肌萎縮；其主要在人體的肝臟中合成，通常形成致病的類淀粉沉積。其中1401號樣品為前血清淀粉樣蛋白P（pre-serum amyloid P， pre-SAP）成分。SAP是一種人類免疫系統(tǒng)的重要蛋白［9］，廣泛存在于淀粉類物質(zhì)中，被認為與慢性炎癥和自身免疫疾病相關。與鑒定的958號樣品匹配的為泰素耐藥相關基因-3（taxol resistant associated gene-3， TRAG-3）。TRAG-3是Duan等［10］在尋找泰素耐藥基因時發(fā)現(xiàn)的一個新的CT抗原，其編碼的蛋白屬于腫瘤/睪丸抗原家族成員。TRAG-3是一個與腫瘤相關的抗原，被作為一個免疫治療的靶標。有研究發(fā)現(xiàn)，TRAG-3細胞毒性T淋巴細胞表位負載樹突狀細胞疫苗在體外能夠有效激發(fā)抗瘤細胞毒性T淋巴細胞的免疫反應［11］。本研究提示，這些基因或蛋白質(zhì)還可能與重癥肌無力發(fā)病的免疫機制相關，但尚待進一步驗證。重癥肌無力是一與免疫相關的疾病，其發(fā)病的具體分子機制尚不十分明確。本研究通過雙向電泳 及質(zhì)譜分析技術，對照正常組，鑒定了8個差異表達蛋白，這為進一步研究該疾病的分子機制提供了基礎。

　　4 致謝

　　感謝龍華醫(yī)院科研實驗室及中國科學院上海生命科學院蛋白質(zhì)組研究分析中心。

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