【摘要】  目的：探討不同劑量的辛伐他汀處理裸鼠體內(nèi)K562細(xì)胞的信號通路的分子變化，以說明辛伐他汀誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)K562細(xì)胞并經(jīng)皮下接種Balb/cnu/nu裸小鼠K562細(xì)胞，構(gòu)建裸小鼠的K562細(xì)胞動(dòng)物模型。 采用缺口末端標(biāo)記技術(shù)TUNEL法檢測辛伐他汀誘導(dǎo)K562細(xì)胞早期凋亡的變化。 采用RTPCR檢測K562細(xì)胞中Ras分子和PI3KAKT信號通路的nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的差異表達(dá)。 結(jié)果： 不同劑量的辛伐他汀能夠誘導(dǎo)裸鼠體內(nèi)K562細(xì)胞凋亡，并隨劑量的增加凋亡率逐漸增高（P<0.01）；不同劑量的辛伐他汀能夠引起nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的表達(dá)差異（P<0.01）。 結(jié)論： 辛伐他汀能夠引起參與K562細(xì)胞凋亡的Ras 分子和PI3KAKT信號通路的基因變化，從一定的角度說明辛伐他汀在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。

　　【關(guān)鍵詞】  辛伐他??；K562細(xì)胞；裸鼠；凋亡

　　0引言

　　慢性粒細(xì)胞白血病（CML）融合基因bcr/abl編碼產(chǎn)物P210bcr/abl可激活Ras， PI3K， STATs等多條信號途徑。 辛伐他汀對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的作用機(jī)制多限于體外研究，有必要觀察和探討其在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的效果和作用機(jī)理。 而且，p21ras和PI3K的上游激活可啟動(dòng)BcrAbl誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其下游靶標(biāo)仍未完全清楚［1］。 我們用辛伐他汀作用裸鼠體內(nèi)K562細(xì)胞，檢測它對裸鼠體內(nèi)K562細(xì)胞的影響，以說明辛伐他汀是否通過引起裸鼠體內(nèi)K562細(xì)胞中Ras分子和Ras下游的PI3KAKT信號通路的分子水平的變化來誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　12只健康裸鼠，雌性，4+周齡，購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心，并飼養(yǎng)于SPF標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室。 辛伐他汀購自中國藥品生物制品檢定所，以無水乙醇溶解后，再加入與辛伐他汀等摩爾的NaOH，50℃水浴2 h，調(diào)整pH值至7.20，過濾除菌，調(diào)節(jié)濃度至0.2 g/L備用。 噻唑藍(lán)、二甲亞砜購自Sigma公司，培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，TUNEL試劑盒為美國Roche公司產(chǎn)品。 Trizol 和逆轉(zhuǎn)錄試劑Rever TraAce購自Bioflux公司，擴(kuò)增的基因引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成，PCR試劑由北京天為時(shí)代科技有限公司提供。

　　1.2方法

　　1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

　　K562細(xì)胞購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心，以含100 mL/L滅活小牛血清，100萬U/L青霉素，80萬U/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃， 5 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　1.2.2慢性粒細(xì)胞白血病動(dòng)物模型的構(gòu)建

　　取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞用PBS洗滌2次，調(diào)整至5×1010/L，于裸鼠右前腋下皮下注射0.4 mL，待接種K562細(xì)胞的3只裸鼠身上的腫瘤組織長到2 cm3左右時(shí)，處死裸鼠。 取腫瘤組織均勻地分成體積相當(dāng)?shù)男K組織進(jìn)行另外12只裸鼠的皮下移植。 待皮下移植的腫瘤組織長到0.5 cm3左右時(shí)，將12只裸鼠隨機(jī)分成3組，對照組4只，腹腔注射生理鹽水0.2 mL，處理組分成2個(gè)劑量組，各4只，T1組注射0.2 g/L的辛伐他汀0.25 mL，T2組注射0.2 g/L的辛伐他汀0.4 mL. 對照組和處理組隔日分別注射生理鹽水和辛伐他汀，連續(xù)6次。

　　1.2.3原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）

　　檢測腫瘤組織細(xì)胞早期凋亡按原位凋亡基因檢測試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞凋亡。 同時(shí)設(shè)立陰性對照和陽性對照，陰性對照不加Tunel混合液，陽性對照加DNase.

　　1.2.4RTPCR檢測

　　RTPCR檢測nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的差異表達(dá)。 取質(zhì)量相等的腫瘤組織進(jìn)行冰上勻漿，按照總RNA提取試劑說明書， 加入1 mL Trizol提取總RNA，紫外分光光儀定量。 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系40 μL，其中總RNA 2 μg， 42℃水浴50 min，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 各基因的正義和反義引物序列分別是nras： F 5′>3′ TACATCGAGACCTCGGCCAA， R 3′>5′ CGTTCACACACGAGAGGACT，產(chǎn)物150 bp； pi3k： F 5′>3′ AACTCTGGGGATGACCTGGA，R 3′>5′ AGGCGGTCACA ACACTCCTA，產(chǎn)物300 bp； akt1 F 5′>3′ AGGGTTGGCTGCACAAACGA， R 3′>5′  GTTGTTGA AGAGACACCGCG，產(chǎn)物150 bp； nfκb1： F 5′>3′ TGAAGTGAT CCAGGCAGCCT，R 3′>5′ CACCTCTGTAGGAAGGCGTT，產(chǎn)物150 bp. pi3k， akt1， nfκb1的內(nèi)參GAPDH1：    5′>3′ACCACAGTCCATGCCATCAC， 3′>5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA；產(chǎn)物450 bp；nras的內(nèi)參GAPDH2：5′>3′GGCCTCCAAGGAGTAAGACC，3′>5′ AGGGGTCTACAT GGCAACTG，產(chǎn)物147 bp.

　　PCR反應(yīng)體系為：總體積25 μL， cDNA 3 μL，上下游引物各1 μL， 2×master mix 12.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL. 擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min， 94℃ 1 min， 59℃ 1 min， 72℃ 1 min， 30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min， 4℃ 30 min. 取10 μL目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物和4 μL GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行25 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用Quantity One軟件分析基因的表達(dá)，組間均數(shù)比較采用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析以及LSDt檢驗(yàn)。

　　2結(jié)果

　　2.1辛伐他汀能誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞凋亡

　　凋亡細(xì)胞判斷及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)凋亡細(xì)胞呈散在分布，細(xì)胞核被染成紅色形態(tài)符合凋亡特征，用Image pro Plus5.0分析免疫組化結(jié)果，結(jié)果采用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。 對照組的凋亡指數(shù)為0.20±0.01，T1組的凋亡指數(shù)為0.50±0.02，T2組的凋亡指數(shù)為0.71±0.04， 三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001， 圖1）。

　　2.2辛伐他汀能夠誘導(dǎo)CML腫瘤組織細(xì)胞nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的差異表達(dá)各基因的RTPCR結(jié)果有一定差異（圖2）。

　　隨著辛伐他汀劑量的加大，K562細(xì)胞中nras mRNA明顯表達(dá)下調(diào)，對照組與處理組之間的nras mRNA差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≈0.000），處理組本身之間的nras mRNA差異表達(dá)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。 pi3k mRNA在對照組與處理組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≈0.000），pi3k mRNA在對照組與T1， T2組的差異表達(dá)分別都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≈0.000）。 處理組本身之間pi3k mRNA的差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≈0.000）。 akt1 mRNA在對照組與處理組之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≈0.000），對照組與T1，T2組的差異表達(dá)分別都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≈0.000），處理組本身之間akt1 mRNA的差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≈0.000）。 對照組與處理組之間的nfκb1 mRNA的差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≈0.000），對照組與T1，T2組nfκb1 mRNA的差異表達(dá)分別都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≈0.000）。

　　3討論

　　慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中的Ras癌基因編碼的21 kd的G蛋白在信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、分化和惡性轉(zhuǎn)移中有重要作用［2-3］。 Ras蛋白要發(fā)生異戊二烯化等翻譯后修飾才能與細(xì)胞膜結(jié)合和具有完整的生物學(xué)活性。 MAPK/ERK通路上的包括Ras在內(nèi)的癌基因和抑癌基因在20％～30％的人類腫瘤中可發(fā)現(xiàn)經(jīng)常性的基因突變。 基于人類腫瘤Ras突變的頻繁性比其他基因高，開發(fā)MAPK/ERK抑制劑這類抗腫瘤藥物是頗具希望的藥理學(xué)策略。 其中一個(gè)策略就是體內(nèi)阻斷癌基因Ras的功能，來抑制Ras的轉(zhuǎn)錄后的翻譯后修飾［3］。 我們研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀注射裸鼠后能引起CML組織的K562細(xì)胞nras mRNA的表達(dá)差異，nras mRNA隨辛伐他汀劑量加大明顯下調(diào)。研究表明K562細(xì)胞BcrAbl能夠依賴PI3K激活下游分子的方式模擬IL3刺激細(xì)胞增殖［4］。 此外，AKT還可直接作用于凋亡信號如Bad和轉(zhuǎn)錄因子forkhead家族或間接調(diào)控P53和NFκB對細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。 因此，AKT是腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。 而我們的研究表明，辛伐他汀在體內(nèi)作用CML組織的K562細(xì)胞后能夠誘pi3k和akt1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)抑制PI3K/AKT通路下游的nfκb1的表達(dá)。

　　PI3K/AKT通路作為一條與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號途徑可受Ras癌蛋白和IL3等多種因素的激活，本實(shí)驗(yàn)中pi3k和akt1 mRNA水平的表達(dá)上調(diào)可能受到K562細(xì)胞中的BcrAbl融和蛋白的激活而被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。 轉(zhuǎn)錄因子NFκB是MEK/MAPK通路下游的一個(gè)靶標(biāo)，雖然NFκB的激活與許多凋亡活動(dòng)的發(fā)生有關(guān)［5］，但它能阻斷許多刺激引起的凋亡效應(yīng)，包括化療藥物。 NFκB的抗凋亡效應(yīng)來自其對凋亡抑制劑的誘導(dǎo)。 NFκB是細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中的重要環(huán)節(jié)，也是預(yù)防癌癥以及增強(qiáng)化療敏感性的一個(gè)理想的治療靶位點(diǎn)［6］。 我們的研究表明，辛伐他汀能夠引起NFκB通路nfκb1的表達(dá)下調(diào)，說明辛伐他汀在體內(nèi)可能通過引起NFκB通路中的nfκb1的表達(dá)下調(diào)參與CML組織K562細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

　　【參考文獻(xiàn)】［1］Ying Lu， Lee Jamieson， Allan R Brasier， et al. NFкB/RelA transactivation is required for atypical protein kinase Cl mediated cell survival［J］。 Oncegene， 2001，20（35）：4777-4792.

　?。?］Reuther GW， Der CJ. The Ras branch of small GTPases： Ras family members dont fall far from the tree［J］。 Curr Opin Cell Biol， 2000， 12（2）：157-165.

　?。?］Reuter CW， Morgan MA， Bergmann L. Targeting the Ras signaling pathway： A rational， mechanismbased treatment for hematological malignancies［J］。 Blood，2000，96（5）：1655-1669.

　　［4］Deininger MW， Goldman JM， Melo JV.The molecular biology of chronic myeloid leukemia［J］。 Blood，2000， 96（10）：3343-3356.

　?。?］Kaltschmidt B， Kaltschmidt C， Hofmann TG， et al. The pro or antiapoptotic function of NFkappaB is determined by the nature of the apoptotic stimulus［J］。 Eur J Biochem， 2000， 67（12）：3828-3835.

　　［6］Bharti AC， Aggarwal BB. Nuclear factorkappa B and cancer： Its role in prevention and therapy［J］。 Biochem Pharmacol， 2002， 64（56）：883-888.