【摘要】  目的：研究外源性TGFβ對肝星狀細(xì)胞系（HSCT6）的激活作用，以及積雪草酸抑制HSCT6細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白合成的藥理作用。 方法：用LDH和MTT實驗測定積雪草酸對HSCT6細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖的影響。 檢測HSCT6細(xì)胞受不同劑量和不同時間TGFβ刺激后表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白的最佳劑量和時間。 以不同劑量的積雪草酸作用于TGFβ活化的HSCT6細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以Western Blot方法檢測積雪草酸對TGFβ活化的HSCT6細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果：TGFβ刺激HSCT6細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白的最佳劑量為1 ng/mL，最佳時間24 h. 10～30 μmol/L積雪草酸可以抑制TGFβ誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。 結(jié)論：外源性TGFβ可激活HSCT6細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白；積雪草酸抑制HSCT6細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。

　　【關(guān)鍵詞】  積雪草酸； Ⅰ型膠原蛋白； HSCT6細(xì)胞； 轉(zhuǎn)化生長因子β

　　0引言

　　傳統(tǒng)中藥積雪草具有促進(jìn)傷口愈合和抑制瘢痕增生藥效［1-2］。  新近的研究表明積雪草能夠抑制瘢痕組織來源的成纖維細(xì)胞的增殖和纖維蛋白的合成［2］。 肝星狀細(xì)胞在肝纖維化過程中起著至關(guān)重要的作用。 本研究以積雪草酸作用于SV40病毒大T抗原轉(zhuǎn)化的肝星狀細(xì)胞（HSCT6），研究積雪草酸對HSCT6細(xì)胞膠原蛋白合成的影響。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　積雪草酸（SIGMA， Cat： 546712）， 黃棕色粉末， 無臭， 味苦。 分子式為C48H78O5， 熔點325℃～330℃，不溶于水，溶于二甲亞砜（DMSO）， 儲存液濃度20 mmol/L. TGF β1（R&D Systems， Cat 240B），儲存液濃度10 mg/mL. HSCT6由紐約Mount Sinai醫(yī)學(xué)院 Friedmen教授贈送，維持培養(yǎng)在低糖型DMEM（Invitrogen）培養(yǎng)基中，添加10 g/L青鏈霉素（Invitrogen）和100 mL/L胎牛血清（Hyclone）。 1×105細(xì)胞2.5 mL鋪6孔培養(yǎng)板， 50 mL/L CO2， 37℃ 培養(yǎng)24 h，換含2 mL/L胎牛血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h. TGFβ劑量實驗組分別加入0.1， 0.5， 1， 2， 5 ng/mL TGFβ，培養(yǎng)24 h后收取細(xì)胞蛋白；TGFβ時間實驗中各組均同樣加入1 ng/mL TGFβ，分別在0， 6， 1， 24， 48 h收取細(xì)胞蛋白；積雪草酸實驗分別加積雪草酸 0， 5， 10， 20， 30 μmol/L，2 h后除空白對照孔外，各孔加1 ng/mL TGFβ，24 h后提取細(xì)胞蛋白。

　　1.2方法

　　1.2.1乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性實驗（LDH）

　　LDH試劑盒購自SIGMA公司。 HSCT6細(xì)胞維持培養(yǎng)在100 mL/L胎牛血清、10 g/L青鏈霉素的DMEM中。 1×105 HSCT6鋪96孔板，細(xì)胞連續(xù)性達(dá)70％，吸棄上清，無血清DMEM 200 μL 洗2次。 2 mL/L胎牛血清DMEM中加入積雪草酸或DMSO，濃度分別為2.5， 5， 10， 20， 30， 40， 60， 80 μmol/L，200 μL加入細(xì)胞培養(yǎng)孔， 20 g/L Triton100作陽性對照，2 g/L胎牛血清DMEM作陰性對照，每劑量組各為3孔，37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)24 h. 將每孔上清吸出置另一96孔板相應(yīng)孔，2000  r/min， 5 min待測。 將原各孔中殘余液體吸干凈，加入含20 g/L Triton100的DMEM 200 μL， 37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)30 min，使細(xì)胞裂解，2000 r/min， 5 min. 按試劑盒操作說明檢測上清中以及細(xì)胞內(nèi)的LDH，以490 nm波長測定A值，LDH釋放率=A上清/（A上清+A細(xì)胞內(nèi)）×100%.

　　1.2.2細(xì)胞增殖活性實驗（MTT）

　　HSCT6細(xì)胞培養(yǎng)方法以及積雪草酸處理濃度和對照組的設(shè)置均與LDH檢測方法中描述的相同。 MTT檢測試劑購自Promega公司。 加入MTT染液在37℃培養(yǎng)4 h， 加入溶解液室溫過夜，測定A570 nm/A650 nm雙波長的吸光度。

　　1.2.3蛋白質(zhì)提取及定量用RIPA（10 g/L Nonidet P40， 1 g/L SDS， 1 mmol/L PMSF， 5 g/L sodium deoxycholate， 1 mmol/L sodium orthovanadate， 10 mmol/L sodium fluoride in PBS）

　　細(xì)胞蛋白裂解液250 μL，將6孔板每孔中的細(xì)胞蛋白收集至1.5 mL離心管管中，超聲粉碎500 W， 3 s×6次，以4℃， 10 000 r/min離心10 min，收取上清。 細(xì)胞蛋白濃度測定按照BioRad Laboratories蛋白測定試劑盒（Cat5000113）說明書來操作。 用RIPA裂解液將蛋白調(diào)節(jié)為一致濃度后，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液（100 mmol/L Tris.HCl， 40 g/L SDS，200 g/L甘油，2 g/L bromophenol blue）。 100℃蛋白變性5 min備用。

　　1.2.4免疫印記40 mL/L積層膠，100 mL/L分離膠，總蛋白20 μg的樣本，加樣至100 mL/L SDSPAGE中電泳100 V，90 min. 然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，150 V，90 min. 轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜。 以50 mL/L脫脂奶粉TBST封閉液室溫下封閉60 min；TBST洗膜。 加入適當(dāng)濃度的一抗孵育，4℃輕搖過夜。 TBST洗膜：加入適當(dāng)濃度的結(jié)合HRP的二抗（1∶10 000至1∶30 000）及HRPantibiotin二抗（1∶5000）孵育，室溫下輕搖60 min. ECL或ECL plus顯影1 min后，在暗室中進(jìn)行曝光2 s~15 min.

　　2結(jié)果

　　2.1積雪草酸對HSCT6細(xì)胞毒性不同濃度組與正常對照組比較，LDH釋放率在30 μmol/L以下時無顯著差異。 40 μmol/L以上時有差異（F=5.21， P<0.05， 圖1）。

　　2.2積雪草酸對HSCT6細(xì)胞的增殖不同濃度組與正常對照組比較，在30 μmol/L以下時，對細(xì)胞增殖無增加和抑制作用。 40 μmol/L以上時顯著抑制細(xì)胞增殖（F=49.04， P<0.05，圖2）。

　　2.3TGFβ增加HSCT6細(xì)胞I 型膠原蛋白表達(dá)的時間和劑量1 ng/mL TGFβ作用HSCT6細(xì)胞24 h，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平最高。 不同劑量TGFβ作用HSCT6細(xì)胞24 h，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平在1 ng/mL TGFβ組最高（圖3A， B）。

　　2.4積雪草酸減少HSCT6細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)10～30 μmol/L的積雪草酸可以抑制TGFβ活化的HSCT6細(xì)胞的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。 溶解積雪草酸（20 μmol/L）組的等體積DMSO無抑制活化的HSCT6細(xì)胞的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)作用（圖4）。

　　3討論

　　TGFβ是重要的致肝纖維化細(xì)胞因子之一。 當(dāng)TGFβ刺激肝星狀細(xì)胞時，肝星狀細(xì)胞活化、轉(zhuǎn)化為肌原成纖維細(xì)胞，分泌含有大量膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)。 HSCT6細(xì)胞是經(jīng)SV40大T抗原轉(zhuǎn)化的大鼠肝星狀細(xì)胞系，具有活化的肝星狀細(xì)胞表型［3］。 為了確定HSCT6細(xì)胞是否能夠接受外源性TGFβ刺激，產(chǎn)生膠原蛋白表達(dá)的變化，不同劑量的TGFβ作用于HSCT6細(xì)胞，免疫印記檢測Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)果顯示1 ng/mL TGFβ誘導(dǎo)HSCT6細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)含量為最高。 以1 ng/mL TGFβ作用HSCT6細(xì)胞，檢測不同時間HSCT6細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)含量，結(jié)果顯示在24 h Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平最高。 外源性TGFβ誘導(dǎo)HSCT6細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)的劑量和時間測定結(jié)果表明TGFβ可以刺激HSCT6細(xì)胞高表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白，HSCT6細(xì)胞系可作為篩選治療肝纖維化藥物的細(xì)胞模型。

　　抑制肝纖維化可以通過抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）的增殖，促進(jìn)HSC細(xì)胞的凋亡，上調(diào)TGFβ/Smad信號途徑中的負(fù)反饋信號Smad7，以及減少抑制性組織金屬蛋白酶（TIMP）等多種途徑實現(xiàn)抑制細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度增生［4-5］。 10~30 μmol/L積雪草酸作用于TGFβ激活的HSCT6細(xì)胞，可以有效抑制其Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平。 在同樣劑量范圍內(nèi)，積雪草酸對HSCT6細(xì)胞的增殖無顯著抑制作用，同時也沒有顯著的細(xì)胞毒性作用。 本研究表明積雪草酸抑制活化的HSCT6細(xì)胞的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)與抑制HSCT6細(xì)胞的增殖和積雪草酸產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用無關(guān)。 在我們的研究中有數(shù)據(jù)顯示10~20 μmol/L 積雪草酸無明顯地促進(jìn)HSCT6細(xì)胞凋亡作用，小于30 μmol/L積雪草酸對Ⅰ型膠原蛋白合成的抑制作用與積雪草酸誘導(dǎo)凋亡作用似乎無關(guān)。 積雪草酸抑制HSCT6細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白合成與Smad2/3和Smad7以及TIMP分子之間的關(guān)系需進(jìn)一步研究。

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