藥理學(xué)實驗設(shè)計縮瞳:
藥理學(xué)實驗設(shè)計的基本原則
一、實驗設(shè)計的基本原則
藥理學(xué)研究的目的是通過動物實驗來認識藥物作用的特點和規(guī)律,為開發(fā)新藥和評價藥物提供科學(xué)依據(jù)。由于生物學(xué)研究普遍存在的個體差異,要取得精確可靠的實驗結(jié)論必須進行科學(xué)的實驗設(shè)計,因此必須遵循以下基本原則。
1、重復(fù):
“重復(fù)”包括兩方面的內(nèi)容,即良好的重復(fù)穩(wěn)定性(或稱重現(xiàn)性)和足夠的重復(fù)數(shù),兩者含意不同又緊密聯(lián)系。有了足夠的重復(fù)數(shù)才會取得較高的重現(xiàn)性,為了得到統(tǒng)計學(xué)所要求的重現(xiàn)性,必須選擇相應(yīng)的適當?shù)闹貜?fù)數(shù)。
統(tǒng)計學(xué)中的顯著性檢驗規(guī)定的P<0.05及P<0.01反映了重現(xiàn)性的高低:“P”表示不能重現(xiàn)的概率。在已達到良好的重現(xiàn)性的條件下,如果P值相同,重復(fù)數(shù)越多的實驗,其價值越小。它說明實驗誤差波動太大,或是兩藥的均數(shù)相差太小。前者提示實驗方法應(yīng)予改進,后者提示兩藥藥效的差別沒有臨床意義?梢姡吭黾訉嶒灷龜(shù)來提高重現(xiàn)性是有一定限度的。
1.1 實驗重復(fù)數(shù)的質(zhì)量
除了重復(fù)數(shù)的數(shù)量問題外,還應(yīng)重視重復(fù)數(shù)的質(zhì)量問題。要盡量采用精密、準確的實驗方法,以減少實驗誤差。同時應(yīng)保證每次重復(fù)都是在同等情況下進行。即實驗時間、地點、條件,動物品系、批次,藥品廠商、批號,臨床病情的構(gòu)成比或動物病理模型的輕重分布應(yīng)當相同。質(zhì)量不高的重復(fù),不僅浪費人力和物力,有時還會導(dǎo)致錯誤的結(jié)論。
1.2 藥理實驗設(shè)計中的例數(shù)問題
實驗結(jié)論的重現(xiàn)性與可靠性同實驗例數(shù)有關(guān),實驗質(zhì)量越高、誤差越小,所需例數(shù)越少,但最少也不能少于“基本例數(shù)”。
實驗動物的基本例數(shù)
(1)小動物(小鼠、大鼠、魚、蛙):計量資料每組10例,計數(shù)資料每組30例。
(2)中動物(兔、豚鼠):計量資料每組6例,計數(shù)資料每組20例。
(3)大動物(犬、貓、猴、羊):計量計數(shù)資料每組5例,計數(shù)資料每組10例。
2、隨機:
“隨機”指每個實驗對象在接受處理(用藥、化驗、分組、抽樣等等)時,都有相等的機會,隨機遇而定。隨機可減輕主觀因素的干擾,減少或避免偏性誤差,是實驗設(shè)計中的重要原則之一。
隨機抽樣的方案有以下幾種:
2.1 單純隨機
所有個體(病人或動物)完全按隨機原則(隨機數(shù)字表或抽簽)抽樣分配。本法雖然做到絕對隨機,但在例數(shù)不多時,往往難以保證各組中性別、年齡、病情輕重等的構(gòu)成比基本一致,在藥理實驗中較少應(yīng)用。
2.2 均衡隨機
又稱分層隨機。首先將易于控制且對實驗影響較大的因素作為分層指標,人為地使各組在這些指標上達到均衡一致。再按隨機原則將各個體分配到各組。使各組在性別、年齡、病情輕重等的構(gòu)成比上基本一致。該法在藥理學(xué)實驗中常用,如先將同一批次動物(種屬、年齡相同)按性別分為2大組,雌雄動物總數(shù)應(yīng)當相同(雌雄各半)。每大組動物再分別按體重分籠,先從體重輕的籠中逐一抓取動物,按循環(huán)分組發(fā)分別放入各組的籠中,待該體重動物分配完畢后,從體重次輕的籠中繼續(xù)抓取動物分組,……直至體重最重的籠中動物分配完畢。
二、藥理實驗設(shè)計中的劑量問題
1、安全劑量的探索:
首先用小鼠作急性毒性實驗, 求出最大耐受量(或LD1)。然后按等效劑量的直接折算法計算出實驗中所用動物的最大耐受量;取其1/3-1/5作為較安全的試用量。
2、劑量遞增方案:
對于非致死性毒性反應(yīng)較明顯的藥物,可先采用較小的劑量(例如LD1的1/50)作預(yù)試,以策安全。試用后如未出現(xiàn)藥效,也無任何不良反應(yīng),可將藥物劑量遞增。每次增幅由100%遞減至30%左右,直至出現(xiàn)明顯藥效或產(chǎn)生明顯不良反應(yīng)。具體方案見下表:
劑量遞增表:
The Increasing of dosage
實驗次數(shù)(Experiment No) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
劑量倍數(shù)(Dosage Times) 1 2 3.3 5 7 9 12 16 21 28 38 50
3、不同種屬動物間的劑量換算:
對于文獻中有在其它種屬動物使用劑量的藥物,可通過劑量換算過渡到實驗需用動物上來。以往常用的標準動物的等效劑量折算系數(shù)法,簡便適用,但不宜用于體重不標準的動物。
不同種屬標準體重動物整體(只)劑量折算倍數(shù)K
Times(K)of Dosage Conversion Between Various Standard WeightAnimals
動物種屬 小鼠 大鼠 豚鼠 兔 貓 猴 犬 人
Animal sorts mouse rat cavy rabbit cat monkey dog human
小鼠mouse(20g) 1 7.0 12.25 27.8 29.7 64.0 124 388
大鼠rat(200g) 0.14 1 1.74 3.9 4.2 9.2 17.8 56.0
豚鼠cavy(400g) 0.08 0.57 1 2.25 2.4 5.2 9.2 31.5
兔rabbit(1.5kg) 0.04 0.25 0.44 1 1.08 2.4 4.5 14.2
貓cat(2.0kg) 0.03 0.23 0.41 0.92 1 2.2 4.1 13.0
猴monkey(4.0kg) 0.016 0.11 0.19 0.42 0.45 1 1.9 6.1
犬dog(12kg) 0.008 0.06 0.10 0.22 0.23 0.52 1 3.1
人human(70kg) 0.0025 0.018 0.031 0.07 0.078 0.16 0.32 1
整體動物劑量(Dosage of a wholeanimal): DB = DA×KB/KA
現(xiàn)介紹一種對任何體重動物都適用的“等效劑量直接折算法”:后面的表列出了不同動物的公斤體重劑量折算的有關(guān)系數(shù)和標準體重整體劑量折算倍數(shù),供計算時使用。
不同種屬動物單位體重(kg)劑量折算系數(shù)
動物種屬 小鼠 大鼠 豚鼠 兔 貓 猴 犬 人
劑量折算系數(shù)K 1 0.71 0.62 0.37 0.30 0.32 0.21 0.11
動物體型系數(shù)R 0.059 0.09 0.099 0.093 0.082 0.111 0.104 0.1
標準體重(kg) 0.02 0.2 0.4 1.5 2 4 12 70
標準體重動物: DB = DA×KB/KA
非標準體重動物: DB = DA×RB/RA×(WA/WB)1/3
三、藥理實驗設(shè)計中的預(yù)試問題
在正式實驗前應(yīng)充分重視預(yù)實驗的重要性,它可大大提高實驗的效率,避免盲目性。通過預(yù)試應(yīng)建立并改進實驗方法、選擇最佳實驗對象、條件及指標。通過預(yù)試應(yīng)對于干擾實驗的因素有明確的了解。通過預(yù)試應(yīng)盡可能提高實驗的穩(wěn)定性和靈敏性。
1、實驗的穩(wěn)定性及其選擇
實驗穩(wěn)定性通?捎猛粯颖局貜(fù)實驗結(jié)果的變異系數(shù)CV表示:
CV=SD / X
實驗變異系數(shù)小于0.05表示穩(wěn)定性好, 大于0.2則表示波動太大, 需改進實驗方法。藥理實驗中可利用CV的測定選擇適當?shù)膭游锬P汀?
2、實驗的靈敏性及其選擇
用藥劑量稍有變化,反應(yīng)強度即出現(xiàn)明顯差異,說明靈敏度較高。靈敏度可用因變系數(shù)C.C.表示:
C.C.=|(R1-R2)/(logD1-log D2)|
式中R1、R2為反應(yīng)強度,D1、D2為相應(yīng)的藥物劑量。
藥理實驗中可利用CV和C.C.的測定選擇最佳的實驗動物、實驗臟器或?qū)嶒灄l件。
3、預(yù)試的任務(wù)及預(yù)試結(jié)果的意義
預(yù)試中應(yīng)有計劃地查明與保證正式實驗成功有關(guān)的各種重要信息,如:動物品種、臟器類型、實驗條件、實驗方法、藥物用量、觀察指標等等。用于預(yù)試所得數(shù)據(jù)是在逐步改進的過程中陸續(xù)收集的,時間差異較大,一般不宜將預(yù)試結(jié)果并入正式實驗結(jié)果。
通過預(yù)備實驗,可擬出實驗記錄的內(nèi)容,以保證正式實驗?zāi)苡袟l理、按順序進行,不致遺漏重要的觀察項目,便于對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。實驗記錄一般包括以下內(nèi)容
(1)實驗標本的條件:如動物的種類、來源、體重、性別、編號等。
(2)實驗藥物的情況:如藥物的來源、批號、劑型、濃度、劑量及給藥途徑等。
(3)實驗的環(huán)境條件:如實驗日期、時間、溫度、濕度等。
(4)實驗進度、步驟及方法的詳細記錄。
(5)觀察指標的變化情況:包括原始記錄和相關(guān)描記圖紙或照片。
(6)資料整理、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及其結(jié)果。
(7)實驗中存在的問題、改進措施,需要進一步探討的問題。
每次實驗都必須隨時記錄,每一階段結(jié)束時,都要對及時進行分析結(jié)果、整理數(shù)據(jù),并畫出必要的統(tǒng)計圖表,作出結(jié)論,寫出報告。
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