分子生物學(xué)方法是一類利用細(xì)胞因子的基因探針檢測特定細(xì)胞因子基因表達(dá)的技術(shù)。目前所有公認(rèn)的細(xì)胞因子的基因均已克隆化,故能較容易地得到某一細(xì)胞因子的cDNA探針或根據(jù)已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探針。利用基因探針檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的方法多種多樣,常使用斑點(diǎn)雜交、Northernblot、逆轉(zhuǎn)錄PCR,細(xì)胞或組織原位雜交等。實驗的關(guān)鍵在于制備高質(zhì)量的核酸探針和獲得合格的待測物(提取的mRNA樣品或細(xì)胞/組織標(biāo)本)。核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標(biāo)記物(如生物素、地高辛等)標(biāo)記并與目的基因互補(bǔ)的DNA片段或單鏈DNA、RNA.根據(jù)其來源可分為cDNA探針、寡核核苷酸探針、基因組基因探針及DNA探針等。其中cDNA探針和人工合成寡核苷酸探針常用于斑點(diǎn)雜交及Northern blot,而RNA探針因穿透性好更適用于原位雜交。核酸醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理探針技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)程序化,以cDNA探針為例主要包括:
?。?)質(zhì)粒DNA的提取;
?。?)靶DNA片段的分離;
?。?)靶DNA片段標(biāo)記;
?。?)待測樣品mRNA的提取;
?。?)標(biāo)記cDNA探針對待檢樣品的雜交;
?。?)放射自顯影或顯色分析。
近年來出現(xiàn)的RT-PCR檢測特異性mRNA的方法也廣泛用于細(xì)胞因子研究領(lǐng)域。該法具有靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn),甚至從1~10個細(xì)胞中就可檢出其中的特異mRNA.
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