免疫熒光顯微技術(shù)的基本原理是：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見(jiàn)明亮的特異熒光。

　　（一）標(biāo)本的制作

　　熒光顯微技術(shù)主要靠觀察切片標(biāo)本上熒光抗體醫(yī)學(xué)教丨育網(wǎng)整理的染色結(jié)果作為抗原的鑒定和定位。因此標(biāo)本制作的好壞直接影響到檢測(cè)的結(jié)果。在制作標(biāo)本過(guò)程中應(yīng)力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和封埋過(guò)程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞或組織間隙中去。標(biāo)本切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標(biāo)本中干擾抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)要充分洗去，有傳染性的標(biāo)本要注意安全。

　　常見(jiàn)的臨床標(biāo)本主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類。按不同標(biāo)本可制作涂片、印片或切片。組織材料可制備成石蠟切片或冷凍切片。石蠟切片因操作煩瑣，結(jié)果不穩(wěn)定，非特異反應(yīng)強(qiáng)等已少應(yīng)用。組織標(biāo)本也可制成印片，方法是用洗凈的玻片輕壓組織切面，使玻片粘上1～2層組織細(xì)胞。細(xì)胞或細(xì)菌可制成涂片，涂片應(yīng)薄而均勻。涂片或印片制成后應(yīng)迅速吹干、封裝。置-10℃保存或立即使用。

　　（二）熒光抗體染色

　　于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體。置醫(yī)學(xué)教丨育網(wǎng)整理濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時(shí)間，一般可用25℃～37℃，30min，不耐熱抗原的檢測(cè)則以4℃過(guò)夜為宜。用PBS充分洗滌，干燥。

　　（三）熒光顯微鏡檢查

　　經(jīng)熒光抗體染色的標(biāo)本，需要在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當(dāng)天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結(jié)果。

　　熒光顯微鏡檢查應(yīng)在通風(fēng)良好的暗室內(nèi)進(jìn)行。首先要選擇好光源或?yàn)V光片。濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重要條件。在光源前面的一組激發(fā)濾光片，其作用是提供合適的激發(fā)光。激發(fā)濾光片有兩種。MG為紫外光濾片，只允許波長(zhǎng)275～400nm的紫外光通過(guò)，最大透光度在365nm；BG為藍(lán)紫外光濾片，只允許波長(zhǎng)325～500nm的藍(lán)外光通過(guò)，最大透光度為410nm?？拷跨R的一組阻擋濾光片（又稱吸收濾光片或抑制濾光片）的作用是濾除激發(fā)光，只允許熒光通過(guò)。透光范圍為410～650nm，代號(hào)有OG（橙黃色）和GG（淡綠黃色）兩種。觀察FITC標(biāo)記物可選用激發(fā)濾光片BG12，配以吸收濾光片OG4或GG9。觀察RB200標(biāo)記物時(shí)，可選用BG12與OG5配合。

　　（四）實(shí)驗(yàn)的類型

　　1.直接法

　　2.間接法

　　3.補(bǔ)體結(jié)合法：本法是在間接法的第一步抗原抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體（多用豚鼠補(bǔ)體），再用熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體進(jìn)行示蹤。本法敏感度高，且只需一種抗體。但易出現(xiàn)非特異性染色，加之補(bǔ)體不穩(wěn)定，每次需采新鮮豚鼠血清，操作復(fù)雜。因此較少應(yīng)用。

　　4.雙標(biāo)記法