熒光抗體的制備包括兩個關(guān)鍵的步驟：抗體的熒光素標(biāo)記和熒光抗體的鑒定。 

　　（一）抗體的熒光素標(biāo)記

　　用于標(biāo)記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應(yīng)含有針對標(biāo)本中正常組織的抗體。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標(biāo)記。作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求：①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。②熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。⑤標(biāo)記方法簡單、安全無毒。⑥與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

　　常用的標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記為例，攪拌標(biāo)記法為：先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液用0.5ml／L pH9.0的碳酸鹽緩沖液平衡，隨后在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續(xù)攪拌4～6h后，離心，上清即為標(biāo)記物。此法適用于標(biāo)記體積較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記時間短，熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當(dāng)會引起較強(qiáng)的非特異性熒光染色。

　　透析法適用于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標(biāo)記比較均勻，非特異染色也較低。方法為：先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，置于含F(xiàn)ITC （異硫氰酸熒光素）的0.01mol／L pH9.4碳酸鹽緩沖液中反應(yīng)過夜，以后再對PBS透析法去除游離色素。低速離心，取上清。

　　標(biāo)記完成后，還應(yīng)對標(biāo)記抗體進(jìn)一步純化以去除未結(jié)合的游離熒光素和過多結(jié)合熒光素的抗體。純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。

　　（二）熒光抗體的鑒定

　　熒光抗體在使用前應(yīng)加以鑒定。鑒定指醫(yī)學(xué)教丨育網(wǎng)整理標(biāo)記包括效價及熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率?？贵w效價可以用瓊脂雙擴(kuò)散法進(jìn)行滴定，效價大于1：16者較為理想。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率（F／P）的測定和計(jì)算的基本方法是：將制備的熒光抗體稀釋至A2801≈1.0，分別測讀A₂₈₀ （蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標(biāo)記熒光素的特異吸收峰，按公式計(jì)算。

　　F／P值越高，說明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體以F／P=1.5為宜，用于活細(xì)胞染色的以F／P=2.4為宜。

　　抗體工作濃度的確定方法類似ELISA間接法中酶標(biāo)抗體的滴定。將熒光抗體自1：4～1：256倍比稀釋，對切片標(biāo)本作熒光抗體染色。以能清晰顯示特異熒光、且非特異染色弱的最高稀釋度為熒光抗體工作濃度。

　　熒光抗體的保存應(yīng)注意防止抗醫(yī)學(xué)教丨育網(wǎng)整理體失活和防止熒光猝滅。最好小量分裝，-20℃凍存，這樣就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。