1.細(xì)胞的選擇和融合：雜交瘤技術(shù)的目的是制備對抗原特異性的單克隆抗體，所以融合一方必須是經(jīng)過抗原免疫的B細(xì)胞，通常選用被免疫動物的脾細(xì)胞，脾淋巴細(xì)胞的主要特征是抗體分泌功能。融合細(xì)胞另一方則要求在培養(yǎng)條件下的永生性，只有腫瘤細(xì)胞才是具備這一條件，所以選擇同一體系的骨髓瘤細(xì)胞，因多發(fā)性骨髓瘤是B細(xì)胞系惡性腫瘤，其特點(diǎn)是穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌免疫球蛋白及細(xì)胞因子、融合率高、是次黃嘌呤磷酸核酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾細(xì)胞融合對象。

　　2.選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用：細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷是細(xì)胞DNA合成的途徑；氨甲蝶呤（A）是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合作用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選取出的缺乏HGPRT細(xì)胞株，醫(yī)學(xué)教*育網(wǎng)整理不能在該培養(yǎng)基上生長，只有融合細(xì)胞具有親代雙方遺傳性能，才能在HAT培養(yǎng)基上長期存活與繁殖。

　　3.有限稀釋與抗原特異性的選擇：細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過程，需在融合細(xì)胞抗體篩選的基礎(chǔ)上進(jìn)行特異性篩選。將融合細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，進(jìn)行克隆化處理，再將陽性細(xì)胞進(jìn)行再次克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株進(jìn)行增殖，再進(jìn)行冰凍，體外培養(yǎng)或動物腹腔接種。

　　圖 雜交瘤技術(shù)操作主要流程示意圖