可溶性抗原制備

　　蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶、補體、細(xì)菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆為良好的可溶性抗原，免疫前常需純化。

　　（一）組織和細(xì)胞抗原的制備

　　1.組織和細(xì)胞抗原的制備：通常需要先將來源于人和動物的組織和細(xì)胞破碎，再經(jīng)一定的方法純化，才能獲得所需的抗原。細(xì)胞破碎方法有：

　?。?）高速組織搗碎機法；

　?。?）研磨法（可用組織勻漿器或乳缽） 組織勻漿液要離心沉淀，沉淀物為組織和細(xì)胞碎片，上清液為提取可溶性抗原的材料。

　　2.組織細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞可溶性抗原制備：除上述機械搗碎獲取外，尚有酶處理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可獲得游離的單個細(xì)胞。

　　細(xì)胞抗原分膜蛋白抗原、細(xì)胞質(zhì)抗原（主要為細(xì)胞器）、細(xì)胞核與核膜抗原，制備這些抗原前均需將細(xì)胞破碎，方法有：

　?。?）反復(fù)凍融法：一般-20℃反復(fù)凍融。

　?。?）超聲破碎法：利用超聲波機械振動原理使細(xì)胞破碎。

　?。?）自溶法：利用組織、細(xì)菌自身酶系統(tǒng)使之裂解。

　?。?）酶處理法：常用溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶等使細(xì)菌或組織裂解。

　?。?）表面活性劑處理法：常用十二烷基硫酸鈉等表面活性劑處理。

　　（二）超速離心分離法

　　用于分離亞細(xì)胞成分和蛋白質(zhì)，是進一步純化的第一次過篩?？煞窒铝蟹椒ǎ?

　　1.差速離心法：低速離心高速離心交替進行，分離大小差異的抗原顆粒；

　　2.梯度密度離心法：是一種區(qū)帶分離法，通過梯度密度離心，使各類分子量的顆粒得以分離，也可以采用梯度柱的形式分離。

　　超速離心分離或梯度密度離心僅適用于少數(shù)大分子抗原及一些比重較輕的抗原，而不適用于大多數(shù)中、小分子抗原。

　　（三）選擇沉淀法

　　選擇沉淀法是采用各種沉淀劑或某些條件使抗原成分沉淀的方法。

　　1.核酸去除法：可采用氯化錳、硫酸魚精蛋白等核酸提取沉淀劑，而核糖核酸降解法更簡便（采用DNA或RNA酶）；

　　2.鹽析沉淀法：常采用硫酸銨使蛋白抗原進行粗篩、提取丙種球蛋白及抗原濃縮；

　　3.有機溶劑沉淀法：常采用乙醇或丙酮；

　　4.水溶性非離子型聚合物沉淀法：常用非離子型聚合物為分子量為2000～6000的聚乙二醇（PEG）。

　　（四）凝膠過濾法

　　又稱分子篩層析。通過凝膠分子篩作用，可將大、中、小三類分子分開，選擇凝膠柱時應(yīng)注意選用適于分離范圍內(nèi)的凝膠。

　　（五）離子交換層析法

　　離子交換層析是利用一些帶電離子基團的凝膠或纖維素醫(yī)學(xué)教*育網(wǎng)整理，吸附帶有相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。常用的離子交換劑有：

　　1.具有離子交換基團的纖維素。

　　2.具有離子交換基團的交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺。

　　3.被覆以離子化物質(zhì)的細(xì)粉。

　　4.凝膠合成的高度交聯(lián)樹脂。

　　（六）親和層析法

　　親和層析是利用生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。如抗原和抗體、酶和酶抑制物、酶蛋白和輔酶、激素和受體、DNA和RNA等之間有特殊親和力，一定條件下，兩者可緊密結(jié)合成復(fù)合物，如將復(fù)合物的一方固定于固相載體上，則可從溶液中分離和提純另一方。

　　1.親和層析支持物的選擇：常用的有瓊脂糖珠（sepharose2B、4B、6B）、瓊脂糖、聚丙乙烯酰胺、多孔玻璃球等。

　　2.配體的選擇：配體指具有親和力的雙方，或與受體特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)物，作為免疫親和層析則為抗原和抗體的同義語。良好配體必須具備抗原和抗體單一特異性；抗原和抗體間有較強親和力；配體有一適宜的化學(xué)基團。

　　3.抗原或抗體與支持物的結(jié)合：結(jié)合的方法很多，可歸納為載體結(jié)合法、物理吸附法、交聯(lián)法、網(wǎng)絡(luò)法。

　　（七）免疫球蛋白片段的制備

　　五種免疫球蛋白都具抗原性、皆可提取及純化，但如分解成片段（如Fab片段、Fc片段、輕鏈片段等）作為免疫原可制備出分辨力更高的特異性抗血清。制備方法有：

　　1.溫和條件下離析亞單位。如改變pH；用鹽酸胍或脲等強變性劑將亞單位分開；

　　2.用還原法或氧化法解離二硫鍵；

　　3.溴化氰裂解法。用溴化氰裂解蛋白質(zhì)肽鏈；

　　4.酶裂解法。如木瓜酶可將IgG醫(yī)學(xué)教*育網(wǎng)整理裂解成2個Fab片段及1個Fc片段；胃蛋白酶可將IgG裂解成F（ab’）₂片段及數(shù)個小片段；胰蛋白酶可將IgG切成不規(guī)則的肽鏈。

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　　主要對純化抗原的含量、理化性質(zhì)、純度及免疫活性進行鑒定，常用方法有酚試劑法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、免疫電泳法、免疫雙擴散法等，實際工作中常幾種方法聯(lián)用作純度鑒定。